- Titel
- Neuronal circuit and molecular pathways linking sleep to aging, memory, and proteostasis in C. elegans
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-991840
- Erstveröffentlichung
- 2025
- Datum der Einreichung
- 15.04.2025
- Datum der Verteidigung
- 13.08.2025
- Abstract (DE)
- Hintergrund Schlaf ist ein grundlegender physiologischer Prozess, der für die Erhaltung der allgemeinen Gesundheit unerlässlich ist. Immer mehr Studien belegen, dass Schlaf eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels, der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase, der Unterstützung des Gedächtnisses und der Förderung kognitiver Fähigkeiten spielt. Schlafmangel wiederum steht in engem Zusammenhang mit einer Vielzahl von Erkrankungen, darunter Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie neurodegenerative Krankheiten wie die Alzheimer-Krankheit (AD, aus dem Englischen für Alzheimer’s disease). Dennoch sind die präzisen neuronalen Netzwerke und molekularen Signalwege, die dem Schlaf zugrunde liegen, bislang nur unzureichend verstanden. Schlaf ist evolutionär im gesamten Tierreich konserviert. Alle bisher untersuchten Tierspezien mit einem Nervensystem zeigen Schlafverhalten. Im Verlauf der evolutionären Entwicklung haben Tiere ihre Nervenzellen diversifiziert, um Schlaf- Wach-Zyklen zu regulieren. Diese Schaltkreise sind bei höher entwickelten Organismen zunehmend komplexer geworden, um den Anforderungen anspruchsvoller Gehirnfunktionen gerecht zu werden. Daher ist es schwierig, Schlaf-Wach-Schaltkreise in höher entwickelten Organismen direkt zu identifizieren, da deren Gehirne eine sehr komplexe Struktur aufweisen. Angesichts der evolutionären Konservierung von Schlaf stellt es eine vielversprechende Forschungsstrategie dar, die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise in einfacheren Modellorganismen aufzudecken und diesesWissen auf komplexere Organismen zu übertragen. Somatostatin (SST) ist ein hochkonserviertes Peptidhormon. Es wurde ursprünglich im Hypothalamus entdeckt, wo es die Ausschüttung des Wachstumshormons hemmt. Neuere Studien deuten darauf hin, dass somatostatin-exprimierende (SST+) Neuronen in verschiedenen Hirnregionen von Säugetieren potenzielle Modulatoren von Schlaf und Gedächtnisbildung darstellen. Die Wirkung von SST auf den Schlaf scheint dabei vom jeweiligen Expressionsort sowie den spezifischen neuronalen Netzwerken abzuhängen, mit denen es interagiert. Es bleibt jedoch unklar, ob SST den Schlaf und Gedächtnisprozesse direkt über seine Rezeptoren reguliert. In Caenorhabditis elegans (C. elegans) besitzt der Hermaphrodit ein relativ einfaches Nervensystem mit 302 Neuronen. Schlaf wird in diesem Organismus streng von einem einzelnen schlafaktiven, schlaffördernden Neuron namens RIS reguliert. Unter bestimmten Bedingungen wird RIS depolarisiert, um Schlaf auszulösen, was verschiedene positive Effekte bewirkt, darunter erhöhte Überlebensraten und Lebensdauer, eine Abschwächung altersassoziierter Phänotypen sowie eine verbesserte Immunfunktion. In einer früheren Studie wurden das Neuropeptid NLP-99 und sein Rezeptor NPR-16 als Homologe des vertebraten SST bzw. des Somatostatinrezeptors (SSTR) identifiziert. Ob die SST-Signalgebung den Schlaf und die damit verbundenen physiologischen Funktionen in C. elegans reguliert, ist jedoch weiterhin unbekannt. Darüber hinaus ist weiterhin unklar, wie RIS Schlaf-Wach-Schaltkreise bildet und wie seine Aktivität gesteuert wird, um verschiedene physiologische Prozesse zu koordinieren. Fragestellung In dieser Dissertation war es mein Ziel, einen neuartigen Schlaf-Wach-Schaltkreis zu identifizieren und die physiologischen Funktionen des Schlafs in C. elegans zu untersuchen. Die zentralen Forschungsfragen, die in dieser Arbeit behandelt wurden, lauten wie folgt: 1) Reguliert der SST-Signalweg den Schlaf und andere physiologische Funktionen in C. elegans? Um die Rolle von RIS im Alterungsprozess weiter zu untersuchen, habe ich analysiert, wie die neuronale Aktivität von RIS alterungsbezogene Prozesse beeinflusst, und bin dabei folgenden Fragen nachgegangen: 2) Wie reguliert die neuronale Aktivität von RIS zelluläre Stressantworten und Proteostasewege, die zur Langlebigkeit beitragen? 3) Verändert sich die neuronale Aktivität von RIS oder die Schlafmenge in einem C. elegans AD-Modell? Methode Zur Analyse der Schlafmenge und der neuronalen Aktivität in spezifischen Neuronen führte ich Langzeit-Mikroskopie in einer Agarose-Mikrokammer durch, wobei Kalzium- Sensoren wie GCaMP zum Einsatz kamen. Die Bewegungsgeschwindigkeit der Tiere wurde ausgewertet, um Schlaf- und Wachzustände anhand einer definierten Schwelle zu unterscheiden (Schlafkriterium: Bewegung < 1 μm über mindestens 1 Minute). Die neuronale Aktivität wurde über die Fluoreszenzintensität gemessen, welche den Kalziumeinstrom widerspiegelt - ein Kennzeichen für neuronale Aktivierung. Zur Untersuchung des neuronalen Schaltkreises und der zugrunde liegenden molekularen Signalwege, die den SST-Signalweg mit der Schlafregulation verbinden, wurden Mutantenstämme entweder vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bezogen, durch Mikroinjektion extrachromosomaler Arrays oder mittels CRISPRbasierter Genomeditierung erzeugt. Die Funktion der Rezeptor-Liganden-Interaktion wurde in Xenopus-Oozyten untersucht, indem NPR-16a gemeinsam mit GIRK-Kanälen exprimiert und durch zwei-Elektroden- Spannungsklemmaufnahmen die durch NLP-99 induzierten Ströme gemessen wurden. Zur Bewertung von Überlebensrate und Lebensdauer wurden über einen bestimmten Zeitraum die Anzahl lebender und toter Tiere gezählt. Die Lipidspeicherung wurde mittels Nile-Red-Färbung quantifiziert. Die Gedächtnisleistung wurde mithilfe chemotaxisbasierter Kurzzeit- und Langzeit-Gedächtnistests bewertet. Zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen habe ich die Aktivität der transkriptionellen Reporter sod- 3p::GFP und sod-5p::GFP analysiert. Um die Aktivität von Proteinqualitätskontrollwegen weiter zu untersuchen, verwendete ich die Reporter hsp-4p::GFP und hsp-6p::GFP, die jeweils auf Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) bzw. in den Mitochondrien hinweisen. Die Aktivität des ER-assoziierten Abbaus (ERAD) wurde mithilfe eines mit YFP markierten ERAD-Substrats bewertet: nhx-2p::CPL-1W32A;Y 35A::YFP, das sich bei beeinträchtigtem ERAD akkumuliert. Ergebnisse Meine Ergebnisse zeigen, dass das wachaktive AIY-Neuron das Neuropeptid NLP-99 freisetzt, welches den Somatostatinrezeptor (SSTR) NPR-16 im schlafaktiven Neuron RIS aktiviert. NPR-16 ist an Gi/o-Proteine gekoppelt und verhindert nach Aktivierung die Freisetzung des schlaffördernden Neuropeptids FLP-11 aus dem RIS-Neuron, wodurch der Schlaf gehemmt wird. Diese Hemmung von RIS und Schlaf über den NLP-99/NPR-16-Signalweg führt zu einer reduzierten Lipidspeicherung und geringerer Überlebensrate. Sowohl das RIS/FLP-11-Signal als auch das NLP-99/NPR-16-Signal sind für die Gedächtniskonsolidierung essenziell. Diese Daten unterstützen ein Modell, in dem die durch Wachheit getriebene AIY/NLP-99-Signalisierung und die durch Schlaf getriebene RIS/FLP-11-Signalisierung einen molekularen Flip-Flop-Schalter bilden, der Übergänge zwischen energieverbrauchender Wachheit und überlebensförderndem Schlaf reguliert und so das Gedächtnis in beiden Zuständen unterstützt. Zudem verkürzt eine Hyperaktivierung des RIS-Neurons die Lebensspanne bei 20◦C, verlängert sie jedoch bei 25◦C - unabhängig vom Schlaf. Dieser Langlebigkeitseffekt ist abhängig von DAF-16 und XBP-1 und steht im Zusammenhang mit einer erhöhten Stressresistenz sowie einer verbesserten Proteostase im endoplasmatischen Retikulum und in den Mitochondrien. Die RIS-Aktivität fördert außerdem die durch ERAD vermittelte Eliminierung fehlgefalteter Proteine. In einem C. elegans-AD-Modell ist der Schlaf reduziert, während die Aktivität des RIS-Neurons erhöht ist. Dies deutet darauf hin, dass Aβ1-42 die Schlafregulation beeinträchtigen könnte, möglicherweise durch eine Störung der Funktion des schlafaktiven RIS-Neurons. Schlussfolgerung In dieser Studie habe ich einen neuartigen neuronalen Schlaf-Wach-Schaltkreis identifiziert, der die evolutionär konservierten Signalwege von SST und Schlaf miteinander verbindet. Während sich frühere Studien vor allem auf die Rolle SST+ Neuronen bei der Schlafregulation konzentrierten, war bislang unklar, ob SST selbst den Schlaf über rezeptorvermittelte Mechanismen direkt moduliert. Hier liefere ich molekulare und zelluläre Beweise dafür, dass NLP-99 (SST), das vom wachaktiven AIY-Neuron ausgeschüttet wird, auf das schlafinduzierende RIS-Neuron über den NPR-16 (SSTR) wirkt, um Schlaf-Wach-Übergänge zu regulieren. Ich zeige, dass SST schlafabhängige physiologische Funktionen wie Lipidstoffwechsel und Überlebensrate moduliert. Darüber hinaus trägt SST durch die Koordination des Gleichgewichts zwischen Schlaf und Wachheit zur Gedächtniskonsolidierung bei. Ich zeige außerdem, dass die Kalziumaktivität des RIS-Neurons die Langlebigkeit fördert, indem sie die Expression von Stressantwortgenen und Proteostase-Wege reguliert. Bemerkenswert ist, dass in einem C. elegans-Modell der AD mit humanem amyloidbeta die Schlafdauer reduziert war, während die Kalziumaktivität des RIS-Neurons paradoxerweise erhöht war.
- Abstract (EN)
- Sleep is a fundamental physiological process that is essential for maintaining overall health. A growing body of research indicates that sleep plays a critical role in regulating metabolism, maintaining protein homeostasis, supporting memory, and promoting cognitive function. Sleep deprivation, in turn, is closely linked to a variety of diseases, including type 2 diabetes, cardiovascular disease, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD). Nevertheless, the precise neural networks and molecular pathways underlying sleep are still poorly understood. Sleep is evolutionarily conserved throughout the animal kingdom. All animal species with a nervous system that have been studied to date exhibit sleep behaviour. In the course of evolutionary development, animals have diversified their nerve cells to regulate sleep-wake cycles. These circuits have become increasingly complex in more highly developed organisms in order to meet the demands of sophisticated brain functions. It is therefore difficult to directly identify sleep-wake circuits in more highly developed organisms, as their brains have a very complex structure. Given the evolutionary conservation of sleep, a promising research strategy is to uncover the underlying neural circuits in simpler model organisms and transfer this knowledge to more complex organisms. Somatostatin (SST) is a highly conserved peptide hormone. It was originally discovered in the hypothalamus, where it inhibits the release of growth hormone. Recent studies suggest that somatostatin-expressing (SST+) neurons in various brain regions of mammals are potential modulators of sleep and memory formation. The effect of SST on sleep appears to depend on the respective site of expression and the specific neural networks with which it interacts. However, it remains unclear whether SST regulates sleep and memory processes directly via its receptors. In Caenorhabditis elegans (C. elegans), the hermaphrodite has a relatively simple nervous system with 302 neurons. Sleep in this organism is strictly regulated by a single sleep-active, sleep-promoting neuron called RIS. Under certain conditions, RIS is depolarised to induce sleep, which has various positive effects, including increased survival rates and lifespan, attenuation of age-associated phenotypes, and improved immune function. In an earlier study, the neuropeptide NLP-99 and its receptor NPR-16 were identified as homologues of vertebrate SST and somatostatin receptor (SSTR), respectively. However, it remains unknown whether SST signalling regulates sleep and related physiological functions in C. elegans. Furthermore, it remains unclear how RIS forms sleep-wake circuits and how its activity is controlled to coordinate various physiological processes. Research question In this thesis, my goal was to identify a novel sleep-wake circuit and to investigate the physiological functions of sleep in C. elegans. The central research questions addressed in this thesis are as follows: 1) Does the SST signalling pathway regulate sleep and other physiological functions in C. elegans? To further investigate the role of RIS in the ageing process, I analysed how the neural activity of RIS influences ageing-related processes, addressing the following questions: 2) How does the neural activity of RIS regulate cellular stress responses and proteostasis pathways that contribute to longevity? 3) Does RIS neuronal activity or sleep amount change in a C. elegans AD model? Method To analyse sleep amount and neuronal activity in specific neurons, I performed long-term microscopy in an agarose microchamber using calcium sensors such as GCaMP. The movement speed of the animals was evaluated to distinguish between sleep and wake states based on a defined threshold (sleep criterion: movement < 1 μm for at least 1 minute). Neuronal activity was measured via fluorescence intensity, which reflects calcium influx – a hallmark of neuronal activation. To investigate the neural circuitry and underlying molecular pathways linking the SST pathway to sleep regulation, mutant strains were either obtained from the Caenorhabditis Genetics Centre (CGC), generated by microinjection of extrachromosomal arrays, or created using CRISPR-based genome editing. The function of the receptor-ligand interaction was investigated in Xenopus oocytes by expressing NPR-16a together with GIRK channels and measuring the currents induced by NLP-99 using two-electrode voltage clamp recordings. To assess survival rate and lifespan, the number of living and dead animals was counted over a specific period of time. Lipid storage was quantified using Nile red staining. Memory performance was assessed using chemotaxis-based short-term and long-term memory tests. To evaluate oxidative stress responses, I analysed the activity of the transcriptional reporters sod-3p::GFP and sod-5p::GFP. To further investigate the activity of protein quality control pathways, I used the reporters hsp-4p::GFP and hsp-6p::GFP, which indicate stress in the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria, respectively. The activity of ER-associated degradation (ERAD) was assessed using a YFP-tagged ERAD substrate: nhx-2p::CPL-1W32A;Y 35A::YFP, which accumulates when ERAD is impaired. Results My results show that the wake-active AIY neuron releases the neuropeptide NLP-99, which activates the somatostatin receptor (SSTR) NPR-16 in the sleep-active RIS neuron. NPR-16 is coupled to Gi/o proteins and, upon activation, prevents the release of the sleep-promoting neuropeptide FLP-11 from the RIS neuron, thereby inhibiting sleep. This inhibition of RIS and sleep via the NLP-99/NPR-16 signalling pathway leads to reduced lipid storage and lower survival rates. Both the RIS/FLP-11 signal and the NLP-99/NPR-16 signal are essential for memory consolidation. These data support a model in which wakefulness-driven AIY/NLP-99 signalling and sleep-driven RIS/FLP-11 signalling form a molecular flip-flop switch that regulates transitions between energy-consuming wakefulness and survival-promoting sleep, thereby supporting memory in both states. Furthermore, hyperactivation of the RIS neuron shortens lifespan at 20°C but prolongs it at 25°C, regardless of sleep. This longevity effect is dependent on DAF-16 and XBP-1 and is associated with increased stress resistance and improved proteostasis in the endoplasmic reticulum and mitochondria. RIS activity also promotes the elimination of misfolded proteins mediated by ERAD. In a C. elegans AD model, sleep is reduced while RIS neuron activity is increased. This suggests that Aβ1-42 may impair sleep regulation, possibly by disrupting the function of the sleep-active RIS neuron. Conclusion In this study, I identified a novel neural sleep-wake circuit that links the evolutionarily conserved signalling pathways of SST and sleep. While previous studies have focused primarily on the role of SST+ neurons in sleep regulation, it was previously unclear whether SST itself directly modulates sleep via receptor-mediated mechanisms. Here, I provide molecular and cellular evidence that NLP-99 (SST), released by the wakeful AIY neuron, acts on the sleep-inducing RIS neuron via NPR-16 (SSTR) to regulate sleep-wake transitions. I show that SST modulates sleep-dependent physiological functions such as lipid metabolism and survival rate. Furthermore, SST contributes to memory consolidation by coordinating the balance between sleep and wakefulness. I also show that RIS neuron calcium activity promotes longevity by regulating the expression of stress response genes and proteostasis pathways. Notably, in a C. elegans model of AD with human amyloid beta, sleep duration was reduced, while RIS neuron calcium activity was paradoxically increased.
- Freie Schlagwörter (DE)
- Schlaf, Schlafmangel, neuronale Schaltkreise, NLP-99, NPR-16
- Freie Schlagwörter (EN)
- Sleep, lack of sleep, Neural circuits, NLP-99, NPR-16
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Klassifikation (RVK)
- WX 3366
- GutachterIn
- Prof. Dr. Henrik Bringmann
- Prof. Dr. Jared Sterneckert
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-991840
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 10.12.2025
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Englisch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
Summary v Zusammenfassung ix List of Figures xix List of Tables xxi Abbreviations xxiii 1 Introduction 1 1.1 The basics of sleep 1 1.1.1 The definition of sleep 1 Behavioral definition of sleep 1 Physiological definition of sleep 1 1.1.2 The importance of sleep 2 Functional importance of sleep 2 Societal and behavioral importance 3 Evolutionary perspective 3 1.2 Neural circuits regulating sleep and wake states 4 1.2.1 Neural circuits of sleep 4 1.2.2 Neural circuits of wakefulness 5 1.3 The role of somatostatin in sleep 6 1.4 ER stress and protein homeostasis 7 1.5 C. elegans as a model organism for studying sleep 9 1.5.1 Biological features of C. elegans as a model organism 9 1.5.2 Regulation and types of sleep in C. elegans 11 1.5.3 The sleep-active sleep-inducing RIS neuron 11 2 Aims 13 3 Materials and Methods 15 3.1 Cultivation and preparation of C. elegans strains 15 3.2 Crossing and genotyping 15 3.3 DNA constructs and extrachromosomal array generation 15 3.4 Genome editing using CRISPR 16 3.5 Long-term Imaging 17 3.5.1 Agarose hydrogel microchamber generation 17 3.5.2 Imaging 18 DIC imaging and sleep detection via frame subtraction 18 Optogenetic experiments 19 Calcium indicator imaging 20 Fluorescence imaging of stress sensors 21 3.6 Survival and Lifespan Assays 22 3.7 Nile Red staining 22 3.8 Learning and memory assays 22 3.9 In vitro electrophysiology recordings 23 3.9.1 Plasmids and RNA preparation 23 3.9.2 Synthetic peptide synthesis 23 3.9.3 Two-electrode voltage-clamp recording 23 4 Results Aim 1 25 4.1 NLP-99 and NPR-16 inhibit sleep 25 4.2 NLP-99 and NPR-16 inhibit FLP-11 release from RIS 28 4.3 AIY neurons release NLP-99 to inhibit sleep via NPR-16 30 4.4 The AIYs are wake-active neurons that inhibit sleep via NLP-99 and NPR-16 31 4.5 NPR-16 acts in RIS to limit sleep 34 4.6 NPR-16 is an inhibitory Gi/o-coupled receptor 36 4.7 NLP-99 and NPR-16 limit survival and lifespan through RIS inhibition 38 4.8 NPR-16 limits intestinal lipid stores through RIS inhibition 40 4.9 RIS/FLP-11 and NLP-99/NPR-16 work in concert to support memory consolidation 40 5 Results Aim 2 45 5.1 Hyperactivated RIS regulates lifespan in a temperature-sensitive manner 45 5.2 Hyperactivated RIS extends lifespan via DAF-16 and upregulates stressresponse genes associated with oxidative stress resistance 46 5.3 Hyperactivated RIS reduces baseline ER stress and extends lifespan via UPRER mediated by XBP-1 48 5.4 Neuronal activity of sleep-active RIS modulates mitochondrial proteostasis via UPRmt 50 5.5 Hyperactivated RIS promotes protein homeostasis by reducing misfolded protein in ER 53 5.6 Reduced sleep and elevated RIS activity in a C. elegans AD model 53 6 Discussion 57 6.1 How does signaling via SST coordinate the diverse physiological processes underlying anabolism, survival, memory formation, and sleep? 57 6.2 How does RIS regulate the aging process through stress responses and protein homeostasis? 59 6.3 Conclusion 60 Acknowledgements 63 References 67 Supplementary Material 79