Alkoholdehydrogenasen für die asymmetrische Reduktion zyklischer Carbonylverbindungen

Frances Stark

AutorIn

Frances Stark

Titel

Alkoholdehydrogenasen für die asymmetrische Reduktion zyklischer Carbonylverbindungen

Zitierfähige Url:

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-990079

Erstveröffentlichung

2025

Datum der Einreichung

17.12.2024

Datum der Verteidigung

14.08.2025

Abstract (DE)

Zinkabhängige Alkoholdehydrogenasen (ADH) sind vielversprechende Biokatalysatoren für die Synthese chiraler Hydroxylverbindungen, da sie Carbonylfunktionen meist mit hoher Stereoselektivität reduzieren können. Ihre Selektivität und die Breite an akzeptierten Substraten machen die ADH der mittelkettigen Dehydrogenasen/ Reduktasen (MDR)- Überfamilie besonders interessant für eine industrielle Anwendung. Die Mehrheit der MDR ADH bevorzugen linear aliphatische und phenylsubstituierte Aldehyde und Ketone. Ihre Substratspezifität und Stereoselektivität resultieren aus zwei unterschiedlich großen hydrophoben Substratbindetaschen, die die Orientierung der Substituenten der Carbonylgruppe vom Substratmolekül im aktiven Zentrum steuern. Die MDR ADH aus Thauera aromatica (ThaADH) katalysiert dagegen bevorzugt die Reduktion sterisch anspruchsvoller alizyklischer Carbonylverbindungen wie die des α-Diketons 1,2-Cyclo-hexandion. Die strukturellen Gründe für die einzigartige Substratspezifität der ThaADH innerhalb der MDR-Überfamilie sind trotz erster Vermutungen noch kaum erforscht. Ziel dieser Arbeit war es daher, die strukturellen Ursachen für die Präferenz zyklischer Carbonylverbindungen aufzuklären und die Eignung des Enzyms für eine industrielle Anwendung zu bewerten. Im Rahmen einer Expressionsoptimierung konnte zunächst die Menge an Biokatalysator verdoppelt und eine beachtliche Aktivitätssteigerung um das 21-Fache erreicht werden. Neben dem für ADH mesophilen Ursprungs typischen temperaturabhängigen Aktivitätsprofil zeigte die ThaADH maximale Reaktionsgeschwindigkeiten bei pH 6,5 (Reduktion) bzw. pH 9,0 (Oxidation). Ihre thermische und pH-abhängige Stabilität betreffend, erwies sich die ThaADH als außerordentlich robust im Vergleich zu verwandten ADH. Die ermittelten Halbwertszeiten von mehreren Tagen (z.B. t1/2, 24 °C= 17 Tage) können einen entscheidenden Vorteil für eine industrielle Anwendung darstellen. Gegenüber organischen Lösungsmitteln zeigte die ThaADH ebenfalls eine vergleichsweise hohe Stabilität. Mit bspw. DMSO und Ethylenglykol stehen verschiedene Additive für den Einsatz in ThaADH-katalysierten Prozessen zur Auswahl, um u.a. eine verbesserte Löslichkeit der meist hydrophoben Substrate zu erreichen und damit die Effizienz der Biokatalyse zu erhöhen. Bei 10 % (v/v) DMSO im Reaktionsansatz zeigte die ThaADH eine hohe Restaktivität von 92 %. Ihre Lösungsmitteltoleranz bewies die ThaADH auch im Zweiphasensystem. Von besonderem Interesse war die Untersuchung der außergewöhnlichen Substratspezifität und der Stereoselektivität. Die ThaADH zeigte eine hohe Substratspezifität und bevorzugte alizyklische Carbonylverbindungen wie das α-Diketon 1,2-Cyclohexandion und α-halogenierte Cycloalkanone. Ein elektronenziehender Substituent in direkter Nachbarschaft zur reagierenden Carbonylfunktion scheint die Umsetzbarkeit der Carbonylverbindungen zu fördern. Aromatische Verbindungen wurden vom Biokatalysator dagegen nicht reduziert, einige linear aliphatische Diketone mit geringer Reaktionsgeschwindigkeit. Mit (S)-2-Hydroxy-cyclohexanon (ee: 75 %) als Hauptprodukt der 1,2-Cyclohexandion-Reduktion folgt die ThaADH der Prelog-Regel ebenso wie viele andere MDR ADH. Neben der (S) Stereoselektivität konnte auch eine (S)-Stereospezifität der ThaADH festgestellt werden. Zur Untersuchung der Struktur-Funktionsbeziehungen der ThaADH wurde zunächst die Enzymstruktur in Kooperation mit Prof. Gideon Grogan (University of York) aufgeklärt. Der Vergleich mit der verwandten Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR2) mit der klassischen Substratpräferenz zeigte entscheidende Unterschiede in der Architektur der aktiven Zentren. Die ThaADH besitzt, entgegen des bei MDR ADH vorherrschenden Zwei-Substratbindetaschen-Modells, eine einzelne große Substratbindetasche, die die Präferenz für zyklische Carbonylverbindungen begünstigen zu scheint. Ursächlich hierfür ist das Fehlen einer sperrigen aromatischen Aminosäure mit Keilfunktion am Taschenboden. Die Modellierung verschiedener Substratmoleküle im aktiven Zentrum der ThaADH führte zur Identifizierung von 15 am Aufbau der Substratbindetasche beteiligten strukturellen Determinanten. Zu diesen zählen der Protonendonor T44 und die koordinierenden Reste des in einer nicht katalytisch aktiven Position vorliegenden katalytischen Zinks C42, H65 und E66. Im Rest W302 könnte wiederum die Ursache für die fehlende Umsetzung γ-substituierter Cycloalkanone liegen. Der Grad der Hydrophobizität der Substratbindetasche, beeinflusst durch Y48 und M113, spielt durch das veränderte Potenzial hydrophobe Wechselwirkungen auszubilden ebenfalls eine Rolle für die Substratspezifität. Mit der ADH aus Deferrisoma camini (DecADH), Geobacter bemidjiensis (GebADH) und Thauera phenylacetica (ThpADH) wurden drei alternative ADH identifiziert und durch heterologe Genexpression in E. coli hergestellt, die eine nahezu identische Substratpräferenz für alizyklische Carbonylverbindungen wie die ThaADH aufweisen. Die ADH zeigten eine hohe strukturelle Ähnlichkeit im aktiven Zentrum, was auf eine hohe Konserviertheit schließen lässt. Mit der DecADH wurde des Weiteren eine thermostabile ADH identifiziert, die für den Einsatz in industriellen Prozessen von besonderem Interesse sein könnte. In dieser Arbeit wurden somit mehrere strukturelle Determinanten für die außergewöhnliche Substratspezifität der ThaADH für alizyklische α-substituierte Carbonylverbindungen identifiziert. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen zinkabhängiger MDR ADH bei. Ihre einzigartige Substratpräferenz kombiniert mit vorteilhaften biochemischen Eigenschaften, verleiht der ThaADH und der thermostabilen DecADH ein hohes Potenzial für die chirale Synthese industriell wertvoller (Zwischen-)Produkte einer bisher nicht erschlossenen Substratklasse.

Abstract (EN)

Zinc-dependent alcohol dehydrogenases (ADH) are promising biocatalysts for the synthesis of chiral hydroxyl compounds, due to their frequent ability to reduce carbonyl groups with high stereoselectivity. Their selectivity and broad substrate range make ADH of the medium-chain dehydrogenase/reductase (MDR) superfamily particularly interesting for industrial applications. Most MDR ADH prefer linear aliphatic and phenyl-substituted aldehydes and ketones. Their substrate specificity and stereoselectivity result from two differently sized hydrophobic substrate-binding pockets that control the orientation of the substituents of the carbonyl group of the substrate molecule in the active site. However, the ADH from Thauera aromatica (ThaADH) preferentially catalyzes the reduction of sterically demanding alicyclic carbonyl compounds such as the α-diketone 1,2-cyclohexanedione. The structural reasons for the unique substrate specificity of ThaADH within the MDR superfamily remain largely unexplored, despite initial hypotheses. Therefore, the aim of this study was to elucidate the structural causes for the preference of cyclic carbonyl compounds and evaluate the enzyme's suitability for industrial applications. Initially, in the course of an expression optimization, the amount of biocatalyst was doubled, and a considerable increase in activity by a factor of 21 was achieved. In addition to the typical temperature-dependent activity profile of ADH with a mesophilic origin, ThaADH showed maximum reaction velocities at pH 6.5 (reduction) and pH 9.0 (oxidation). In terms of thermal and pH stability, ThaADH proved to be exceptionally robust compared to related ADH. The determined half-lives of several days (e.g., t1/2, 24 °C = 17 days) could offer an outstanding advantage for industrial applications. The ThaADH also exhibited relatively high stability in the presence of organic solvents. For example, with DMSO and ethylene glycol, various additives are available for use in ThaADH-catalyzed processes to improve the solubility of the typically hydrophobic substrates and thereby enhance the efficiency of biocatalysis. At 10% (v/v) DMSO in the reaction mixture, ThaADH exhibited a high residual activity of 92%. ThaADH also demonstrated its solvent tolerance in a two-phase system. Of particular interest was the investigation of the exceptional substrate specificity and stereoselectivity. ThaADH showed a high substrate specificity and favored alicyclic carbonyl compounds such as the α-diketone 1,2-cyclohexanedione and α-halogenated cycloalkanones. The presence of an electron-withdrawing substituent in close proximity to the reacting carbonyl group appears to promote the reducibility of the carbonyl compounds. In contrast, aromatic compounds were not reduced by the biocatalyst, while some linear aliphatic diketones were accepted with low reaction rates. With (S)-2-hydroxycyclohexanone (ee: 75 %) as the main product of the 1,2-cyclohexanedione reduction, ThaADH follows the Prelog rule as well as many other MDR ADH. In addition to the (S)-stereoselectivity, ThaADH was also found to be (S)-stereospecific. To investigate the structure-function relationships of ThaADH, the enzyme structure was first solved in cooperation with Prof. Gideon Grogan (University of York). The comparison with the related carbonyl reductase from Candida parapsilosis (CPCR2), which exhibits the conventional substrate preference, revealed decisive differences in the architecture of the active site. Contrary to the two substrate binding pockets prevalent in MDR ADH, ThaADH has a single large substrate binding pocket that favors the preference for cyclic carbonyl compounds. This can be attributed to the absence of a bulky aromatic amino acid with a wedge-like function at the bottom of the pocket. The modeling of different substrate molecules in the active site of ThaADH led to the identification of 15 structural determinants defining the substrate binding pocket. These include the proton donor T44 and the coordinating residues of the active zinc in a non-catalytically active position C42, H65, and E66. The residue W302 could in turn be the reason for the lack of conversion of γ-substituted cycloalkanones. The degree of hydrophobicity of the substrate binding pocket, influenced by Y48 and M113, also plays a role in substrate specificity due to the altered potential to form hydrophobic interactions. With the ADH from Deferrisoma camini (DecADH), Geobacter bemidjiensis (GebADH) and Thauera phenylacetica (ThpADH), three alternative ADHs were identified and produced by heterologous gene expression in E. coli, which show an almost identical substrate preference for alicyclic carbonyl compounds as ThaADH. The ADH showed a high structural similarity in the active site, suggesting a high degree of conservation. DecADH was also identified as a thermostable ADH that could be of particular interest for use in industrial processes. Thus, several structural determinants for the exceptional substrate specificity of ThaADH for alicyclic α-substituted carbonyl compounds were identified in this work. The insights gained contribute to a better understanding of the structure-function relationships of zinc-dependent MDR ADH. The uniqueness in the substrate preference combined with favorable biochemical properties gives ThaADH and the thermostable DecADH a high potential for the chiral synthesis of industrially valuable intermediates and products of a previously unexplored substrate class.

Freie Schlagwörter (DE)

Biokatalyse, Zinkabhängige MDR-ADH, Enzymstruktur-Funktionsbeziehung, ADH aus Thauera aromatica (ThaADH), α-substituierte Carbonylverbindungen

Freie Schlagwörter (EN)

Biocatalysis, Zinc-dependent MDR ADH, Enzyme structure-function relationship, ADH from Thauera aromatica (ThaADH), α-substituted carbonyl compounds

Klassifikation (DDC)

570

Klassifikation (RVK)

VK 5587

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