- Titel
- Einfluss von Enzalutamid auf Expression und Turnover des Androgenrezeptors
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-989019
- Erstveröffentlichung
- 2025
- Datum der Einreichung
- 26.03.2025
- Datum der Verteidigung
- 02.09.2025
- Abstract (DE)
- Weltweit wird das Prostatakarzinom (PCa) 1,5 Mio. Mal jährlich neu diagnostiziert. Mit etwa 397.000 Todesfällen pro Jahr belegt das PCa Rang 5 der krebsbedingten Todesursachen. Während das lokalisierte, Organ-beschränkte PCa eine sehr gute Prognose mit einem 5-Jahres-Überleben von bis zu 99 % hat, liegt die Prognose bei Diagnosestellung eines metastasierten PCas nach 5 Jahren bei nur etwa 30 %. Somit stellt insbesondere die Behandlung des fortgeschrittenen PCas weiterhin eine wichtige klinische Herausforderung dar. In diesem Zusammenhang hat sich die pharmakologische Modulation der Androgenrezeptor (AR)-Signalwege als bedeutende Therapieoption etabliert. Der AR ist ein Steroidhormonrezeptor, der als Liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor die biologischen Funktionen der Androgene (z.B. Testosteron) vermittelt. Er ist essenziell für die physiologische Entwicklung, Wachstum und Aufrechterhaltung der Prostata. Ebenso ist das PCa auf die pro-proliferativen Signalwege des ARs angewiesen, weshalb die Hormontherapie seit mehr als 50 Jahren einen wesentlichen Bestandteil der systemischen Behandlung des fortgeschrittenen PCas ausmacht. Initial beschränkte sich dieser Therapieansatz auf die hormon-ablative Androgendeprivationstherapie (ADT). Unter der ADT kommt es jedoch regelhaft zum Wiederanstieg des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) und der Entwicklung eines kastrationsresistenten PCas (CRPC). Das PSA-kodierende Gen KLK3 ist Target-Gen des ARs und es wird vermutet, dass der Wiederanstieg des PSAs im Serum in Abwesenheit von biologisch verfügbaren Androgenen Ausdruck einer androgen-unabhängigen Reaktivierung der AR-Signalwege darstellt. Daher wurden Wirkstoffe entwickelt, die spezifisch den AR antagonisieren, die sogenannten Antiandrogene und die später entwickelten Androgenrezeptor-Signalweg-Inhibitoren (ARSIs). Enzalutamid (Enz) war die erste Substanz dieser ARSIs, die erstmals 2012 durch die FDA zugelassen wurde und mittlerweile Bestandteil der Erstlinientherapie des kastrationssensiblen als auch -resistenten, metastasierten PCas ist. Allerdings wird auch eine Resistenzentwicklung gegenüber Enz beobachtet. Hierbei werden unter anderem Resistenzmechanismen diskutiert, die zu einer verbesserten AR-Proteinstabilität führen. Einfluss auf die Proteinstabilität können viele zelluläre Faktoren nehmen. Der AR ist jedoch ein Protein mit kurzer Halbwertszeit, das vorrangig durch Hitzeschockproteine (HSPs) im Zytoplasma stabilisiert und über das Proteasom abgebaut wird. Die vorangegangene Arbeit von Abazid et al. (2019) zeigte, dass Enz die intrazelluläre AR-Proteinkonzentration senkt als auch stabilisierende HSPs supprimiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, wie Enz Einfluss auf das AR-Protein nimmt. Prinzipiell kann die Proteinmenge einer Zelle durch die vier Faktoren Transkriptionsrate, Halbwertszeit der mRNA, Translationsrate und Halbwertszeit eines Proteins determiniert werden. Für diese Arbeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Enz-vermittelte HSP-Suppression die Stabilität des AR-Proteins senkt, indem dieser proteasomal abgebaut wird. Zur Überprüfung der Arbeitshypothese sollte der Enz-vermittelte Abbau des ARs durch das Proteasom untersucht werden. In der Arbeit wurde ausschließlich die hormonsensitive, humane Prostatakarzinomzelllinie LNCaP verwendet. LNCaP Zellen wurden mit 10 µM Enz behandelt: die Zellproliferation wurde durch Zellzählungen mit Hilfe des CASY TT cell counters untersucht, die AR mRNA mittels Real-Time Quantitative PCR und die intrazelluläre AR-Proteinkonzentration wurde durch die Western Blot Methode bestimmt. Für die Untersuchung der Proteasomaktivität wurden zwei Proteasominhibitoren, Bortezomib (Bor) und MG-132 (MG) verwendet. Mit Hilfe des Proteasomaktivitätsassays wurde die Aktivität der β5-Untereinheit des Proteasoms untersucht und somit die Wirksamkeit der Proteasominhibitoren überprüft. Diese Methode basiert auf der fluorogenen Reaktion, die initiiert wird, wenn eine intakte β5-Untereinheit den Fluoreszenzfarbstoff AMC vom Substrat Suc-LLVY-AMC abspaltet. Zur Charakterisierung der Proteasominhibitoren wurde für beide Wirkstoffe zunächst eine Dosis-Wirkungs-Kurve erstellt und hemmkinetische Untersuchungen mit LNCaP Zellen durchgeführt. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Proteasominhibitoren auf die AR-Proteinkonzentration mittels Western Blot untersucht. Mit Hilfe der Ergebnisse sollte eine passende Substratkonzentration als auch Behandlungsdauer für die darauffolgenden Kombinationsversuche erarbeitet werden. Abschließend wurde zur Beantwortung der Fragestellung eine kombinierte Behandlung der LNCaP Zellen mit Enz und Bor oder MG durchgeführt. Es bestätigte sich, dass 10 µM Enz die Zellproliferation der LNCaP Zellen zeitabhängig hemmt und die intrazelluläre AR-Proteinkonzentration bereits ab 6 h senkt. Nachgewiesen wurde ebenfalls, dass die Behandlung mit 10 µM Enz innerhalb von 24 h bis 72 h zu einer unveränderten AR mRNA führt. Die Behandlung der LNCaP Zellen mit MG oder Bor zeigte einen suppressiven Effekt auf das Zellwachstum. Um eine Akkumulation des AR-Proteins durch Proteasominhibition zu erzielen, wurde eine deutlich höhere Konzentration als die berechnete halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC50) angewendet. Durch 20 nM Bor konnte das AR-Protein innerhalb der ersten 6 h akkumuliert werden, mit 5 µM MG konnte dies für die ersten 4 h gezeigt werden. Nach 24 h Behandlungsdauer wurde das AR-Protein durch beide Proteasominhibitoren herunterreguliert. Entsprechend der Ergebnisse wurde für die darauffolgenden Kombinationsversuche 20 nM Bor bzw. 5 µM MG ausgewählt. Für diese Wirkstoffkonzentrationen konnte im Rahmen des Proteasomaktivitätsassays eine suffiziente Aktivitätshemmung der β5-Untereinheit gezeigt werden. Im Kombinationsversuch von Enz und MG, wurden die LNCaP Zellen zunächst 24 h mit Enz vorinkubiert, und anschließend für 2 h bzw. 4 h zusätzlich mit MG behandelt. Durch eine 2-stündige MG-Behandlung konnte dem Enz-vermittelten AR-Abbau signifikant entgegengewirkt werden. Dies konnte jedoch nach der 4-stündigen Behandlung nicht mehr nachgewiesen werden. Kombinierte man Enz und Bor, konnte nach 2 h, 4 h als auch 6 h Behandlungsdauer mit Bor, die AR-Suppression durch Enz zu keinem Zeitpunkt antagonisiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass Enz den AR posttranskriptional reguliert, da die AR mRNA durch die Enz-Behandlung unverändert blieb. Auch konnte gezeigt werden, dass die Enz-vermittelte Suppression des AR-Proteins ein frühes Ereignis (nach 6 h) im Wirkmechanismus darstellt. Jedoch scheint die Enz-vermittelte Suppression nicht vorwiegend durch den proteasomalen Abbau zu erfolgen, da der spezifischere Proteasominhibitor Bor dem Enz-vermittelten AR-Abbau nicht signifikant entgegenwirken konnte. So kann diskutiert werden, dass der proteasomale Abbau des ARs durch Enz einen von mehreren beteiligten Mechanismen darstellt, um das AR-Protein zu supprimieren. Daher schlussfolgern wir, dass die Beteiligung alternativer Abbauwege in der Regulation der AR-Stabilität durch Enz wahrscheinlich ist. Möglich wäre beispielsweise die lysosomale Proteolyse im Rahmen der Autophagie, die Hemmung der AR-Translation oder auch der Abbau durch unspezifische Proteasen wie Cathepsin D oder Calpain. Um die Senkung der AR-Proteinkonzentration durch Enz genauer zu verstehen, müssten daher weitere Untersuchungen durchgeführt werden, wie beispielsweise eine kombinierte Behandlung von Enz mit einem Autophagie-Inhibitor.
- Andere Ausgabe
- Enzalutamide-induced Proteolytic Degradation of the Androgen Receptor in Prostate Cancer Cells Is Mediated Only to a Limited Extent by the Proteasome System
DOI: 10.21873/anticanres.15113
Link: https://ar.iiarjournals.org/content/41/7/3271.long - Freie Schlagwörter (DE)
- Androgenrezeptor, Enzalutamid, proteasomaler Abbau, Protein-Turnover, Bortezomib, MG-132, Proteasominhibition
- Freie Schlagwörter (EN)
- androgen receptor, enzalutamide, proteasomal degradation, protein turnover, proteasome inhibition
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Klassifikation (RVK)
- XH 1804
- GutachterIn
- PD Dr. Holger Erb
- Prof. Dr. Gustavo Baretton
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- Version / Begutachtungsstatus
- publizierte Version / Verlagsversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-989019
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 03.12.2025
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY-NC-ND 4.0- Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1.1 Das Prostatakarzinom 1.1.1 Pathologie 1.1.2 Klinik und Diagnostik 1.1.3 Therapie 1.1.4 Prognose 1.1.5 Enzalutamid 1.2 Der Androgenrezeptor 1.2.1 Struktur des ARs 1.2.2 Androgene 1.2.3 Bedeutung des ARs für die Prostata und das PCa 1.2.4 Funktionen und molekulare Mechanismen des ARs 1.2.5 Stabilität des ARs 1.3 Die Proteostase 1.3.1 Das 26S Proteasom der Eukaryoten und das Ubiquitin-Proteasom-System 1.3.2 Hitzeschockproteine 2 Zielsetzung 3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3 3.1.1 Geräte 3.1.2 Software und Programme 3.1.3 Verbrauchsmaterialien 3.1.4 Chemikalien und Reagenzien 3.1.5 Puffer und Lösungen 3.1.6 Zellkulturmedien 3.1.7 Marker und Probepuffer 3.1.8 Antibiotika 3.1.9 Wirkstoffe 3.1.10 Antikörper 3.1.11 Kits 3.1.12 Primer 3.1.13 Zelllinien 3.2 Methoden 3.2.1 Zellbiologische Methoden 3.2.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.3 Proteinbiochemische Methoden 3.2.4 Proteasomaktivitätsassay 3.2.5 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Inhibitorischer Effekt von Enz auf Zellwachstum und das AR-Protein, jedoch nicht auf die AR mRNA 4.2 Bor führt zur Hemmung der proteasomalen Aktivität 4.3 Charakterisierung der antiproliferativen Wirkung von Bor 4.4 Konzentrations- und zeitabhängige Wirkung von Bor auf die AR- Proteinkonzentration 4.5 Kombinierte Behandlung mit den Wirkstoffen Enz und Bor 4.6 MG führt zur Hemmung der proteasomalen Aktivität 4.7 Charakterisierung der antiproliferativen Wirkung von MG 4.8 Zeitabhängige Wirkung von MG auf die AR-Proteinkonzentration 4.9 Kombinierte Behandlung mit den Wirkstoffen Enz und MG 5 Diskussion 5.1 Enz reguliert den AR posttranskriptional, posttranslational oder durch Proteindegradation 5.1.1 Regulation der AR-Proteinstabilität durch Proteasom und HSPs 5.1.2 Autoregulation der AR mRNA und Protein 5.2 Wirkung von PIs auf LNCaP Zellen und AR 5.2.1 Wirkmechanismen der PIs in Tumorzellen 5.2.2 Wirkung der PIs auf das AR-Protein 5.3 Einfluss von Enz auf den proteasomalen Abbau des ARs in LNCaP Zellen 5.4 Inhibition der intrazellulären AR-Proteinkonzentration über alternative Wege 5.4.1 Autophagie 5.4.2 Posttranskriptional 5.5 Limitationen 5.6 Schlussfolgerung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summery 8 Literaturverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis 10 Abbildungsverzeichnis 11 Danksagung 12 Anhang