- Titel
- Antigen-spezifische proliferative T-Zell-Antwort in vitro
- Untertitel
- Erstellung altersabhängiger Referenzbereiche im Kindes- und Jugendalter
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-964868
- Erstveröffentlichung
- 2025
- Datum der Einreichung
- 26.07.2024
- Datum der Verteidigung
- 25.03.2025
- Abstract (DE)
- Für die klinische Immunologie stehen diagnostisch deskriptive und funktionelle Analysen zur Verfügung. Ergänzend zur beschreibenden Immunphänotypisierung ist die funktionelle Testung von Immunzellen eine wichtige diagnostische Erweiterung. Dazu zählt der FACS-basierte T-Zellproliferationstest, welcher die unspezifische und spezifische T-Zellfunktion überprüft. Insbesondere können durch Testung auf spezifische Recall-Antigene T-Zell-Defekte aufgedeckt werden, die man bei unauffälliger Proliferation auf stärkste Stimuli (Mitogene) übersehen würde. Um die Ergebnisse, vor allem in der pädiatrischen Immunologie sinnvoll bewerten zu können, werden Referenzwerte gesunder Probanden unterschiedlicher Lebensalter benötigt, welche jedoch in der Literatur fehlen. Ziel dieser Arbeit war es daher, altersabhängige Referenzwerte für die Proliferation auf spezifische Recall-Antigene zu erstellen. Des Weiteren sollte die Proliferation zwischen kryokonservierten und frischen Proben verglichen werden, um die Eignung kryokonservierter Proben zu evaluieren. Der FACS-basierte Proliferationstest wurde an frischen und kryokonservierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gesunder Spender zwischen 6 Lebensmonaten und 18 Jahren durchgeführt. Als Fluoreszenzfarbstoff wurde CellTrace Violet verwendet. Die verwendeten Recall-Antigene waren Tetanus Toxoid, CMV, Candida und Adenovirus. Referenzwerte (n=48) wurden anhand kryokonservierter PBMCs erstellt. Außerdem wurde anhand von 10 Proben die Proliferation von kryokonservierten und frischen PBMCs derselben Probanden verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die T-Zellproliferation auf virale Antigene jenseits des Säuglingsalters mit zunehmendem Alter stärker ausfiel. Die Proliferation auf Candida war hingegen bereits im Säuglingsalter nachweisbar. Bemerkenswerterweise konnten wir keinen Zusammenhang zwischen der Proliferation auf Tetanus Toxoid und Impfabstand feststellen. Für die klinische Routine eignet sich die Messung aus kryokonservierten Proben. Verglichen mit der Messung aus frischen PBMCs waren die spezifischen T-Zellantworten in der Regel stärker, aber in sich kongruent, so dass die Verwendung kryokonservierter PBMCs eine verlässliche Alternative darstellt. Referenzwerte wurden für vorliegende Arbeit über die „genormte“ Proliferation und nicht den Stimulation-Index (SI) angegeben, da Schwankungen des Stimulation-Indexes durch variable Proliferation der unstimulierten Probe keine klinisch relevanten Unterschiede abbilden. Diese altersabhängigen Referenzwerte wurden mittlerweile in die webbasierte Kommunikationsplattform für das Befundmanagement des Uniklinikums Dresden integriert und findet bei der Befundung der T-Zellproliferationsteste täglich Anwendung. Unsere Studie zeigt, dass Referenzwerte altersabhängig, aber nicht regelhaft abhängig vom Abstand zur letzten Impfung variieren. Besonders Candida eignet sich als zuverlässiger Parameter für eine normale T-Zellfunktion über alle Altersgruppen hinweg. Die Durchführung dieses aufwändigen Testes für mehrere Proben parallel ist aufgrund des Gebrauchs kryokonservierter PBMCs machbar und zuverlässig. In Zukunft sollten weitere Referenzwerte erhoben werden, um die Fallzahlen und damit die Aussagekraft der Referenzwerte zu erhöhen. Dabei ist die Erweiterung des Altersspektrums (>18 Jahre) zu überlegen.
- Abstract (EN)
- Background/Hypothesis: Diagnostic descriptive and functional analyses are available for clinical immunology. Functional testing of immune cells is an important diagnostic extension in addition to descriptive immunphenotyping. This includes FACS-based T cell proliferation assays assessing nonspecific and specific T cell function. By assessing T cell proliferation upon specific recall antigens, we are able to detect more subtle T cell defects otherwise overlooked when stimulating with potent stimuli (mitogens) only. Reference values of healthy individuals of various ages are needed – which are currently not available in literature - to properly evaluate results, especially in pediatric immunology. This study therefore aims to establish age-dependent reference values for T cell proliferation upon specific recall antigens. Additionally, proliferation between cryopreserved and fresh samples was compared to evaluate whether cryopreserved samples are suitable or not. Methodes: The FACS-based proliferation assay was performed on fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors between 6 months and 18 years of age. PBMCs were labeled with the fluorescent dye CellTrace Violet to visualize cell division. Recall antigens used were tetanus toxoid, CMV, candida, and adenovirus. Reference values (n=48) were generated using cryopreserved PBMCs. In addition, proliferation of cryopreserved and fresh PBMCs from the same donors was compared using 10 samples. Results: Our results show that T cell proliferation upon stimulation with viral antigens was regularly observed and more pronounced in older age groups of healthy donors. In contrast, there was a robust proliferation upon stimulation with candida in healthy donors of all ages including infants. Interestingly, no correlation was found between proliferation to tetanus toxoid and the vaccination interval. Cryopreserved samples are suitable for routine clinical testing. Compared to fresh PBMCs, specific T cell responses were generally stronger but consistent, which indicates the use of cryopreserved PBMCs as a reliable alternative. Reference values in this study were listed by 'normalized' proliferation rather than the stimulation index (SI), as fluctuations in the SI due to variable proliferation of the unstimulated sample does not reflect clinically relevant differences. These age-dependent reference values have since been integrated into the web-based communication platform for diagnostic management of the University Hospital Dresden and are used daily for the evaluation of T cell proliferation tests. Conclusion: Our study shows that reference values vary with age but not consistently with the interval since the most recent vaccination. In particular, Candida is suitable as a reliable parameter for normal T cell function across all age groups. Performing this laborious assay for multiple parallel samples is feasible and reliable due to use of cryopreserved PBMCs. In future, further reference values should be collected to increase the sample size and consequently the significance of the reference values. An expansion of the age range (>18 years) should also be considered.
- Freie Schlagwörter (DE)
- Immunologie, Kinderheilkunde, T-Zell-Proliferation, FACS-basierte Methoden
- Freie Schlagwörter (EN)
- Immunology, paediatrics, T-cell proliferation, FACS-based methods
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Klassifikation (RVK)
- XD 3024
- GutachterIn
- Prof. Dr. med. Catharina Schütz
- Prof. Dr. med. Peter Mirtschink
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- Version / Begutachtungsstatus
- publizierte Version / Verlagsversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-964868
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 28.05.2025
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
Einleitung 1 1.1 Zielsetzung 1 1.2 Das humane adaptive Immunsystem 1 1.2.1 Antigenpräsentation und Antigenerkennung über den T-Zell-Rezeptor 2 1.2.2 Aktivierung und Differenzierung zu T-Effektorzellen 4 1.2.3 Bildung des immunologischen Gedächtnisses 7 1.3 Farbstoffverdünnungsverfahren zur Analyse der T-Zellproliferation 8 1.4 Grundlagen der Kryokonservierung 13 Materialien und Methoden 14 2.1 Materialien 14 2.1.1 Chemikalien 14 2.1.2 Medien und Lösungen 14 2.1.3 Stimuli 16 2.1.4 Antikörper und Zellfärbung 17 2.1.5 Geräte und Software 17 2.1.6 Sonstige Materialien 18 2.2 Methoden 20 2.2.1 Definition der Studienpopulation 21 2.2.2 Isolation mononukleärer Zellen des peripheren Blutes 22 2.2.3 Verfahren zur Zellzählung 23 2.2.3.1 CASY Cell Counter 23 2.2.3.2 Neubauer-Zählkammer 24 2.2.4 Kryokonservierung und Auftauen der PBMCs 24 2.2.5 Stimulierung der PBMCs durch Mitogene und spezifische Antigene 25 2.2.6 Durchflusszytometrie 27 2.2.6.1 Auswahl geeigneter Farbstoffe 27 2.2.6.2 Färbung und FACS-Analyse 29 2.2.7 Gating mit FlowJo 29 2.2.8 Statistische Auswertung 31 Ergebnisse 32 3.1 Charakterisierung der Studienpopulation 32 3.2 Vergleich der T-Zellproliferation aus über Nacht gelagerten Proben zu Proben nach Kryokonservierung 33 3.3 Erstellung von Referenzbereichen der T-Zellproliferation auf spezifische Antigene nach Altersgruppen 40 3.4 Schwankungen bei mehrfacher Messung derselben Probe 50 3.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die T-Zellproliferation 53 3.6 Gegenüberstellung des Stimulation-Indexes und der Background-Subtraktion 55 Diskussion 56 Zusammenfassung 61