Suizid-Gentherapie mit dem Pseudomonas Exotoxin PE38 zur Behandlung des Glioblastoms

Dr. rer. medic. Lissy Jilek

AutorIn

Dr. rer. medic. Lissy Jilek

Titel

Suizid-Gentherapie mit dem Pseudomonas Exotoxin PE38 zur Behandlung des Glioblastoms

Zitierfähige Url:

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-963805

Erstveröffentlichung

2025

Datum der Einreichung

29.11.0204

Datum der Verteidigung

17.03.2025

Abstract (DE)

Das Glioblastom, eines der häufigsten vom Gehirn ausgehenden Neoplasien, stellt ein prominentes Beispiel für komplexe Tumore mit enorm schlechter Überlebensprognose dar. Aufgrund vielfältiger intrinsischer und extrinsischer Resistenzmechanismen ist die Behandlung des Glioblastoms nach wie vor eine enorme Herausforderung. Angesichts der begrenzten Wirksamkeit und erheblichen Nebenwirkungen klassischer Krebstherapien richtet sich die aktuelle Forschung verstärkt auf innovative Ansätze. Gentherapien, vor allem jene mit viralen Vektoren, zeigen vielversprechende Ergebnisse. Jedoch bleiben Risiken wie immunogene Reaktionen oder Insertionsmutagenese, als auch Hürden der Produktion bestehen. Nicht-virale Vektorsysteme, die bakterielle Amplifikation erfordern, sind aufgrund der bakteriellen DNA-Motive, welche Immunreaktionen auslösen und die Transgenexpression stilllegen können, ebenfalls problematisch. Die vorliegende Arbeit hatte die Etablierung einer neuartige Gentherapie mit Hinblick auf die Umgehung der beschriebenen Herausforderungen zum Ziel. Hierfür wurde das vielversprechende nicht-virale zwei-Plasmid-System der Sleeping Beauty (SB)100x-Transposase in Kombination mit der Minicircle (MC)-DNA-Technologie gewählt. Der Einsatz von MCs als Basisplasmide bietet dabei ein verbessertes Sicherheitsprofil durch die Entfernung des bakteriellen Plasmid-Rückgrats und damit der immunogenen DNA-Motive. Das Transposon-System umfasst ein Plasmid mit dem therapeutischen Gen in Form eines Transposons und ein weiteres Plasmid, das die SB100x-Transposase kodiert. Diese sorgt für die stabile und effiziente Integration des Transposons in das Wirtsgenom. Zu Beginn der Arbeit wurden entsprechend die Transposon-Basis-Plasmide erstellt, in welche nachfolgend das jeweilige therapeutische Gen eingebracht wurde. Im Anschluss galt es ein geeignetes Gen für die therapeutische Anwendung zur Behandlung von Glioblastom-Zellen zu finden, wofür verschiedene Gene in Zellkultur auf ihre Wirksamkeit untersucht wurden. Begonnen wurde mit dem Gen für das INCENP1-405, eine verkürzte Variante des INCENP-Proteins. INCENP1-405 verdrängt das endogene INCENP und verhindert den Abschluss einer ordnungsgemäßen Zellteilung. Im Zusammenhang mit gentherapeutischen Ansätzen zur Behandlung maligner Tumore wurde INCENP1-405 bisher nicht verwendet. In dieser Arbeit wurde INCENP1-405 als potenzielles therapeutisches Gen in den zuvor generierten pMC eingebracht und mittels Polyethylenimin (PEI) in Zellkulturen transfiziert und auf seine Wirksamkeit untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass mittels viraler Vektoren eingebrachtes INCENP1-405 sowohl Zellteilungsstörung als auch ein signifikant verringertes Zellüberleben induzierte. Effekte in vergleichbarer Deutlichkeit konnten jedoch nicht durch PEI-Transfektion der pMC-INCENP1 405-Plasmide erzielt werden. Aufgrund der begrenzten Wirksamkeit der hier verwendeten pMCs wurde die Weiterentwicklung der Gentherapie mit INCENP1-405 eingestellt und die Suche nach einem alternativen Gen fortgeführt. Als ein vielversprechender Kandidat wurde das hochzytotoxische Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa (PE), genauer die verkürzte 38 kDa-Variante PE38, gewählt. Das Exotoxin A wirkt hochzytotoxisch durch Inhibition des eukaryontischen Elongationsfaktor 2 (eEF2), wodurch die Proteintranslation verhindert und als Folge Apoptose induziert wird. Bisher wurde PE38 umfangreich im Rahmen rekombinanter Immunotoxine (RITs) eingesetzt, deren Anwendung jedoch aufgrund ihrer hohen Immunogenität vor Herausforderungen steht. Die Kombination des PE38-Gens mit dem MC-SB100x-Transposon-System stellt einen in dieser Arbeit erstmals vorgestellten, vielversprechenden gentherapeutischen Ansatz dar. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die entsprechenden pMC-Vektoren erfolgreich generiert und mittels PEI-Transfektion in Zellkulturen eingebracht. Die Voruntersuchungen erzielten interessante Resultate hinsichtlich der Suppression des Green Fluorescent Protein (GFP)-Markers in HEK293T-Zellen und deuteten auf eine funktionale und effektive Aktivität des Toxins hin. Folglich wurde das PE38-Gen im vorgesehenen gentherapeutischen Format untersucht: Hierfür wurden zunächst die entsprechenden MC-Vektoren SB100x-GFP sowie PE38-PuroR, bzw. des Kontrollvektors 0-PuroR, aus deren pMC-Plasmiden produziert. Anschließend wurde mittels HEK293T-Zellen sowie der Diphtherie-Toxin-resistenten Zelllinie HEK293FT-DPH1KO die Funktionalität der MCs sowie die PE38-Expression evaluiert. Da PE38 ähnlich dem Diphtherietoxin seine zytotoxische Wirkung durch Inhibition des eEF2 ausbildet, waren die HEK293FT-DPH1KO-Zellen in der Lage die Transfektion des MC-SB100x-Transposon-PE38-Systems zu überleben. Somit konnte die erfolgreiche Gen- sowie Proteinexpression von PE38 nachgewiesen werden. Im Rahmen weiterführender Versuche wurde die MC-SB100x-Transposon-PE38-Gentherapie in den permanenten Glioblastom-Zelllinien H4 und U87-MG sowie in den primären Glioblastom-Zelllinien HT18584 und HT16360-1 untersucht. Trotz einiger Herausforderungen, wie unter anderem zum Teil schwachen Transfektionseffizienzen, zeigte die Gentherapie vielversprechende Resultate: Es konnte erfolgreich eine Beeinträchtigung der GFP-Proteinsynthese sowie der Zellvitalität und eine signifikante Reduktion des langfristigen Zellüberlebens nachgewiesen werden. Die Implementierung der SB100X-Transposase zusammen mit dem potenten PE38-Toxin könnte in verschiedenen Szenarien den Effekt des PE38 unterstützen oder sicherstellen. Beispielsweise kann eine geringe Transfektionseffizienz dazu führen, dass nicht genügend PE38-Protein in den Zellen gebildet wird, um Apoptose auszulösen. Ein stabiler Einbau und eine damit längerfristige und konstante Produktion des PE38-Proteins könnte in solchen Fällen das Gleichgewicht zugunsten der Apoptose verschieben. Die Gesamtheit aller Befunde zeigte eine hohe Wirksamkeit der MC-SB100x-Transposon-PE38-Gentherapie und damit ein vielversprechendes Potenzial als effektive Strategie für die gentherapeutische Behandlung von Glioblastom-Zellen. Für den selektiven Transport der MC-SB100x-Transposon-PE38-Gentherapie in die Tumorzellen wurde zum Abschluss dieser Arbeit ein tumorspezifisches hybrides-Polyplex-System vorgeschlagen. Dieses setzt sich zusammen aus Maltose- und β-Cyclodextrin-modifizierten Poly(propylenimin) (PPI)-Dendrimeren, an welche tumorspezifische Einzelkettenantikörper mittels Neutravidin-Biotin-Bindung gekoppelt wurden. Als Zielstruktur des Einzelkettenantikörpers wurde auf den Tumorzellen die Variante III des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFRvIII) gewählt, die ausschließlich auf verschiedenen soliden und metastasierenden Krebserkrankungen, wie Glioblastom, Mamma- oder Ovarialkarzinom exprimiert wird. Zellkulturen wurden mit dem Hybrid-Polyplex-System transfiziert und mittels GFP-Expressionsanalyse analysiert. Die Resultate wiesen auf eine selektive Internalisierung des oberflächenfunktionalisierten Maltose-modifizierten Dendrimers von EGFRvIII-positiven Zellen hin. Das tumorspezifische Hybrid-Polyplex-System erscheint dabei aussichtsreich für die Etablierung einer selektiven Dendrimer-basierten Gentherapie für Patienten mit Hirntumoren, die durch die Expression der Variante III des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors gekennzeichnet sind. Die in dieser Arbeit erstmals vorgestellten vielversprechenden MC-SB100x-Transposon-PE38-Gentherapie, scheint sehr gut geeignet für die Kombination mit einer solchen selektiven Gentherapie des Glioblastoms und rechtfertigt fortführende Untersuchungen.

Abstract (EN)

Glioblastoma, one of the most common neoplasms originating in the brain, is a prominent example of complex tumors with an extremely poor survival prognosis. Due to multiple intrinsic and extrinsic resistance mechanisms, the treatment of glioblastoma remains an enormous challenge. In view of the limited efficacy and considerable side effects of conventional cancer therapies, current research is increasingly focusing on innovative approaches. Gene therapies, especially those using viral vectors, are showing promising results. However, risks such as immunogenic reactions or insertional mutagenesis as well as production hurdles remain. Non-viral vector systems that require bacterial amplification are also problematic due to bacterial DNA motifs, which can trigger immune reactions and shut down transgene expression. The aim of the present work was to establish a novel gene therapy with a view to circumventing the challenges described. For this purpose, the promising non-viral two-plasmid system of Sleeping Beauty (SB)100x transposase in combination with minicircle (MC) DNA technology was chosen. The use of MCs as base plasmids offers an improved safety profile by removing the bacterial plasmid backbone and thus the immunogenic DNA motifs. The transposon system comprises a plasmid with the therapeutic gene in the form of a transposon and another plasmid encoding the SB100x transposase. This ensures the stable and efficient integration of the transposon into the host genome. At the beginning of the work, the transposon base plasmids were created accordingly, into which the respective therapeutic gene was subsequently introduced. The next step was to find a suitable gene for therapeutic use in the treatment of glioblastoma cells, for which the efficacy of diverse genes was tested in cell culture. The study began with the gene for INCENP1-405, a truncated variant of the INCENP protein. INCENP1-405 represses the endogenous INCENP and prevents the completion of proper cell division. INCENP1-405 has not yet been used in the context of gene therapy approaches for the treatment of malignant tumors. In this work, INCENP1-405 was introduced as a potential therapeutic gene into the previously generated pMC and transfected into cell cultures using polyethylenimine (PEI) and examined for its efficacy. The results showed that INCENP1-405 introduced by viral vectors induced both cell division arrest and significantly reduced cell survival. However, effects of comparable clarity could not be achieved by PEI transfection of the pMC-INCENP1 405 plasmids. Due to the limited efficacy of the pMCs used here, the further development of gene therapy with INCENP1-405 was terminated and the search for an alternative gene was continued. The highly cytotoxic exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa (PE), more precisely the truncated 38 kDa variant PE38, was further selected as a promising candidate. Exotoxin A has a highly cytotoxic effect by inhibiting eukaryotic elongation factor 2 (eEF2), which prevents protein translation and induces apoptosis. To date, PE38 has been used extensively in the context of recombinant immunotoxins (RITs), but their application faces challenges due to their high immunogenicity. The combination of the PE38 gene with the MC-SB100x transposon system represents a promising gene therapy approach presented for the first time in this work. In the further course of the work, the corresponding pMC vectors were successfully generated and introduced into cell cultures by means of PEI transfection. The preliminary investigations yielded interesting results regarding the suppression of the Green Fluorescent Protein (GFP) marker in HEK293T cells and indicated a functional and effective activity of the toxin. Consequently, the PE38 gene was investigated in the intended gene therapeutic format: For this purpose, the corresponding MC vectors SB100x-GFP as well as PE38-PuroR, respectively of the control vector 0-PuroR, were first produced from their pMC plasmids. The functionality of the MCs and PE38 expression was then evaluated using HEK293T cells and the diphtheria toxin-resistant cell line HEK293FT-DPH1KO. Since PE38 exerts its cytotoxic effect similar to diphtheria toxin by inhibiting eEF2, the HEK293FT-DPH1KO cells were able to survive the transfection of the MC-SB100x transposon-PE38 system. Thus, the successful gene and protein expression of PE38 could be demonstrated. In further experiments, MC-SB100x transposon PE38 gene therapy was investigated in the permanent glioblastoma cell lines H4 and U87-MG as well as in the primary glioblastoma cell lines HT18584 and HT16360-1. Despite some challenges, including poor transfection efficiencies in some cases, the gene therapy showed promising results: Impairment of GFP protein synthesis as well as cell viability and a significant reduction in long-term cell survival were successfully demonstrated. The implementation of the SB100X transposase together with the potent PE38 toxin could support or ensure the effect of PE38 in various scenarios. For example, low transfection efficiency may result in insufficient PE38 protein being produced in the cells to trigger apoptosis. In such cases, a stable incorporation and thus a longer-term and constant production of the PE38 protein could shift the balance in favor of apoptosis. The totality of all findings showed a high efficacy of MC-SB100x transposon PE38 gene therapy and thus a promising potential as an effective strategy for the gene therapy treatment of glioblastoma cells. For the selective transport of the MC-SB100x transposon PE38 gene therapy into the tumor cells, a tumor-specific hybrid polyplex system was proposed at the end of this work. This is composed of maltose- and β-cyclodextrin-modified poly(propyleneimine) (PPI) dendrimers, to which tumor-specific single-chain antibodies were coupled by means of neutravidin-biotin binding. Variant III of the epidermal growth factor receptor (EGFRvIII), which is exclusively expressed on various solid and metastatic cancers such as glioblastoma, breast or ovarian cancer, was selected as the target structure of the single-chain antibody on the tumor cells. Cell cultures were transfected with the hybrid polyplex system and evaluated by GFP expression analysis. The results indicated a selective internalization of the surface-functionalized maltose-modified dendrimer of EGFRvIII-positive cells. The tumor-specific hybrid polyplex system appears promising for the establishment of a selective dendrimer-based gene therapy for patients with brain tumors characterized by the expression of variant III of the epidermal growth factor receptor. The promising MC-SB100x transposon-PE38 gene therapy presented for the first time in this work appears to be very well suited for combination with such a selective gene therapy for glioblastoma and justifies further investigations.

Freie Schlagwörter (DE)

Suizid-Gentherapie, PE38, SB100x, Minicircle, Glioblastom

Freie Schlagwörter (EN)

Suicide-Gentherapy, PE38, SB100x, Minicircle, Glioblastoma

Klassifikation (DDC)

610

Klassifikation (RVK)

XH 8554

GutachterIn