Funktionelle Charakterisierung einer Variante unklarer Signifikanz im Malic Enzyme 1 (ME1) Gen identifiziert in einem Melanom mit hohem Malat-Gehalt

Dr. med. Laura Hebestreit

AutorIn

Dr. med. Laura Hebestreit

Titel

Funktionelle Charakterisierung einer Variante unklarer Signifikanz im Malic Enzyme 1 (ME1) Gen identifiziert in einem Melanom mit hohem Malat-Gehalt

Zitierfähige Url:

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-963371

Erstveröffentlichung

2024

Datum der Einreichung

15.05.2024

Datum der Verteidigung

24.09.2024

Abstract (DE)

Die metabolische Reprogrammierung hat sich als ein wesentliches Merkmal der Tumorentstehung etabliert und damit auch in der medizinischen Forschung stark an Bedeutung gewonnen. Beispielsweise kann die Untersuchung des metabolischen Profils von Tumorproben genutzt werden, um Mutationen in Metabolismus-assoziierten Genen zu identifizieren. Einige dieser Mutationen oder die damit zusammenhängenden metabolischen Veränderungen können einen Angriffspunkt für neue Therapien bieten und ermöglichen die Verbesserung der molekularen Stratifizierung von Tumoren. Mit diesem Ziel wurden in einem vorangegangenen Projekt die Citratzyklus-assoziierten Metaboliten von 240 Melanomen untersucht. Dabei wurde ein Melanom mit einem stark erhöhten Malat-Ketoglutarat-Verhältnis identifiziert. Durch die Sequenzierung mit einem Panel, welches 84 bekannte Krebs- und Metabolismus-assoziierte Gene beinhaltete, wurde in diesem Melanom eine Variante unklarer Signifikanz (VUS) im Malic Enzyme 1 Gen (ME1) festgestellt. Dieses Gen codiert für das Malic Enzyme 1 (ME1), welches im Zytosol die Reaktion von Malat zu Pyruvat unter Bildung von NADPH katalysiert. Bei der Variante ME1 c.441C>A p.Ala147Ala handelt es sich um eine synonyme Mutation im ersten Codon des Exon 5. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, inwieweit die Variante ME1 c.441C>A ursächlich für den hohen Malat-Gehalt des Melanoms sein könnte. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass die Variante sich, aufgrund ihrer Position am Intron-Exon-Übergang, in einem für das Spleißen relevanten Bereich befindet. Sie könnte daher über ein alternatives Spleißen von ME1 die Funktion des Enzyms beeinträchtigen. Basierend darauf wird vermutet, dass ein Funktionsverlust von ME1 zu einer Akkumulation von Malat in den betroffenen Zellen führt, da Malat nicht länger zu Pyruvat verstoffwechselt wird. Aufgrund der engen Verbindung des zellulären Stoffwechsels mit der Zellproliferation, wird zudem die Hypothese formuliert, dass ein Funktionsverlust von ME1 zu einer Beeinträchtigung der Proliferation führt. Zur experimentellen Überprüfung dieser Hypothesen wurden zwei Gruppen von Zellmodellen in drei verschiedenen Zelllinien (HAP1, A375 und HEK293T) hergestellt. Die Einführung der Variante ME1 c.441C>A erfolgte durch Prime Editing, während für den vollständigen ME1 Knock-out ein CRISPR/Cas9-System mit drei verschiedenen sgRNAs verwendet wurde. Anschließend erfolgte die Charakterisierung der Zellmodelle, welche die Analyse des metabolischen Profils mittels LC-MS/MS sowie durch ein Isotopen-Tracer-Experiment mit 13C5-Glutamin, die Untersuchung der Zellproliferation und die Betrachtung der Genexpression mittels RNA-Sequenzierung und Western Blot umfasste. Der Effekt der Variante auf das Spleißen von ME1 wurde über eine PCR mit cDNA der mutierten Zellen und anschließender Sanger-Sequenzierung bestimmt. Es wurde eine deutlich höhere Effektivität des ME1 Knock-outs im Vergleich mit dem Prime Editing für die Variante festgestellt. Ein ME1 Knock-out (ME1KO) gelang in allen drei Zelllinien. Jedoch konnte lediglich in den HEK293T-Zellen ein homozygot ME1 c.441C>A mutierter Klon (ME1mut) erzeugt werden. Außerdem wurden einige heterozygot mutierte Klone (ME1mut/WT) in HAP1 und HEK293T-Zellen generiert. Die Untersuchung der Citratzyklus-assoziierten Metaboliten ergab in keiner der untersuchten Zelllinien, weder in den ME1KO-Zellen noch in den ME1mut/WT- oder ME1mut-Zellen, einen signifikant erhöhten Malat-Gehalt verglichen mit den ME1 wildtypischen Zellen (ME1WT). Auch im Isotopen-Tracer-Experiment konnte keine Malat-Akkumulation in den Zellmodellen nachgewiesen werden. Vielmehr zeigte die Untersuchung des relativen Flusses durch ME1 eine unbeeinträchtigte Umwandlung von Malat zu Pyruvat in den ME1KO-Zellen. Die RNASequenzierung bestätigte hingegen die fehlende ME1-Expression in den ME1KO-Zellen. Im Western Blot konnte kein ME1-Protein mehr in diesen Zellen nachgewiesen werden. Daraus lässt sich ableiten, dass in den Zellen ein Kompensationsmechanismus für den Verlust von ME1 existiert. Die Untersuchung der differentiell exprimierten Gene zwischen den ME1KO- und den ME1WT-Zellen ergab jedoch keinen Anhalt für eine kompensatorisch veränderte Genexpression. In der RNA-Sequenzierung konnte zudem auch keine erhöhte Expression der Isoform ME2 in den ME1KO-Zellen festgestellt werden. In Western Blots zeigte sich nur in den A375 ME1KO-Zellen eine gering gesteigerte ME2 Expression. Die Proliferationsexperimente in den A375-Zellen ergaben eine signifikant verlängerte Verdopplungszeit bei ME1KO-Zellen im Vergleich zu den parentalen Zellen. In den HEK293T ME1KO-Zellen zeigte sich dieser Effekt nur bei Kultur in Medium ohne Pyruvat. Weder die homozygote noch die heterozygote Variante führte zu einer signifikant veränderten Verdopplungszeit. In den HAP1-Zellmodellen konnte dagegen unter keiner der untersuchten Bedingungen ein Einfluss des Knock-outs oder der Variante auf die Zellproliferation festgestellt werden. Schlussendlich konnte passend zum fehlenden Einfluss auf Malat-Gehalt und Proliferation auch kein alternatives Spleißen von ME1 aufgrund der Variante nachgewiesen werden. Auch der komplette ME1 Knock-out führte in den Zellmodellen nicht zu einer Akkumulation von Malat. Eine Erklärung dafür könnte die Verstoffwechslung des Malats durch andere Enzyme bieten, auch wenn diesbezüglichen keine eindeutigen Veränderungen der Genexpression gezeigt werden konnten. Eine Betrachtung posttranslationaler Modifikationen und des metabolischen Flusses könnten hier mögliche Ausgangspunkte für weitere Untersuchungen sein. Die unterschiedlichen Ergebnisse der Proliferationsexperimente in den ME1KO-Zellmodelle deuten zudem auf eine variable Abhängigkeit der Zelllinien von ME1, auch im Kontext der Nährstoffverfügbarkeit, hin.

Freie Schlagwörter (DE)

Malic Enzyme 1, Malat, Variante unklarer Signifikanz

Freie Schlagwörter (EN)

Malic enzyme 1, malate, variant of unclear significance

Klassifikation (DDC)

610

Klassifikation (RVK)

XH 9154

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