- Titel
- Physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Phosphodiesterase 2A (PDE2A) im Herzen
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-944267
- Erstveröffentlichung
- 2024
- Datum der Einreichung
- 30.05.2024
- Datum der Verteidigung
- 08.11.2024
- Abstract (DE)
- Kardiale Arrhythmien können zum plötzlichen Herzstillstand (SCD) bei Herzinsuffizienz (HF)-Patienten führen und stellen in diesen Zusammenhang die häufigste Todesursache (> 50 %) dar. Aufgrund der schlechten Prognose werden weitere Therapiemöglichkeiten und Wirkstoffe benötigt. Die Phosphodiesterase 2 (PDE2A), ein cAMP und cGMP hydrolysierendes Enzym, ist im Endstadium bei HF-Patienten hochreguliert. Die PDE2A zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, durch cGMP allosterisch aktiviert zu werden, welches die PDE2A Hydrolyseaktivität vor allem gegenüber cAMP stark steigert. In vorangegangenen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die herzspezifische PDE2A3-Überexpression in Mäusen eine starke anti-arrhythmische Wirkung vermittelt. Andere Studien wiederum zeigten, dass eine pharmakologische Hemmung der PDE2A dem hypertrophen Wachstum von Kardiomyozyten entgegenwirkt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Rolle der PDE2A für die Herzfunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen mit Hilfe eines herzspezifischen PDE2A Knockout Modells zu untersuchen. Weiterhin war das Ziel den PDE2A-vermittelten cGMP/cAMP-Crosstalk-Mechanismus unter Verwendung des natriuretischen Peptids Typ C (CNP) in frisch isolierten murinen sowie humanen von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-KM) zu charakterisieren, um potentielle anti-arrhythmogene kardioprotektive Wirkungen der cGMP-vermittelten PDE2A Stimulation aufzudecken. Zunächst wurde ein neues Mausmodell mit Kardiomyozyten-spezifischer Deletion der PDE2A (PDE2A-KO) unter der Verwendung der „knockout-first“ Strategie generiert und mittels Echokardiographie charakterisiert. Das Fehlen der PDE2A Expression in Kardiomyozyten führte zu keinem veränderten kardialen Phänotyp. Unter chronischen Stressbedingungen nach Isoprenalininfusion (osmotische Minipumpe, 14 Tage) zeigte der PDE2A-KO eine verminderte Kontraktion und Auswurffraktion im Vergleich zu den behandelten Kontrolltieren. Herzfrequenz und Hypertrophie unterschieden sich dabei nicht voneinander. Um den Einfluss der CNP-vermittelten PDE2A Aktivierung auf pro-arrhythmische intrazelluläre Signale zu untersuchen, wurden spontane lokale Ca2+ Freisetzungen aus dem SR (Ca2+ Sparks, CaSp) sowie arrhythmische Ca2+-Wellen (CaW) sowie die Kontraktion von isolierten ventrikulären und atrialen Kardiomyozyten quantifiziert. Interessanterweise reduzierte CNP signifikant die Anzahl an arrhythmogenen CaSp und CaW nach akuter β-adrenerger Stimulation, ohne dabei die zelluläre Kontraktilität zu beeinflussen. Dieser anti-arrhythmogene Effekt wurde in den PDE2A-KO Tieren nicht beobachtet bzw. wurde durch die spezifische PDE2A-inhibition mittels Bay 60-7550 vollständig aufgehoben. Eine simultane Hemmung der cGMP-aktivierten Proteinkinase G hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der CaSp. Zusätzlich zeigten Versuche mit isolierten Kardiomyozyten von Mäusen mit herzspezifischen PDE2A3-Überexpression eine deutlich verminderte Anzahl an CaSp nach akuter β-adrenerger Stimulation. Dieser protektive Effekt wurde bei spezifischer PDE2-Hemmung verhindert. Während die alleinige Inhibition der PDE2 keinen Einfluss auf die CaSp Frequenz hatte, steigerte die Hemmung der PDE3 und PDE4 die Anzahl der CaSp in Kardiomyozyten von Kontrolltieren signifikant. Von besonderer Bedeutung ist, dass der CNP/cGMP/PDE2A-vermittelte anti-arrhythmogene Effekt auch in humanen ventrikulären sowie atrialen iPSC-KMs reproduziert werden konnte. Auf zellulärer Ebene wurden die stressinduzierten Ca2+-Lecks in humanen Zellen durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation unterdrückt. CNP vermittelte auf zellulärer Ebene starke anti-arrhythmogene Effekte über die Stimulation der PDE2A. Interessanterweise war die Expression von CNP in humanem ventrikulärem Gewebe von Patienten mit Herzinsuffizienz signifikant vermindert, während ANP und BNP hochreguliert waren und damit eine Desensitisierung ihrer Rezeptoren vermitteln könnten. In isolierten murinen Kardiomyozyten induzierte die CNP-vermittelte PDE2 Aktivierung eine signifikante Verminderung der intrazellulären cAMP Level. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit unterstreichen deutlich die klinische Relevanz der PDE2A als potenzielles therapeutisches Ziel bei ventrikulären Herzrhythmusstörungen sowie bei Vorhofflimmern nach akuter Stressstimulation oder bei HF weiter zu untersuchen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass PDE2A eine entscheidende Rolle in der Unterdrückung akuter stressinduzierter arrhythmogener Ca2+-Lecks spielt. Daher könnte die pharmakologisch gesteigerte PDE2A-Aktivität eine neue kardioprotektive Strategie zur Therapie von Arrhythmien bei HF darstellen.
- Abstract (EN)
- Cardiac arrhythmias can lead to sudden cardiac death (SCD) in heart failure (HF) patients and are the most common cause of death (> 50%) in this context. Due to the poor prognosis, additional therapeutic options and agents are needed. Phosphodiesterase 2 (PDE2A), an enzyme that hydrolyzes cAMP and cGMP, is upregulated in end-stage HF patients. PDE2A can be allosterically activated by cGMP, which significantly increases its hydrolytic activity, particularly towards cAMP. Previous studies have shown that heart-specific overexpression of PDE2A3 in mice has a strong anti-arrhythmic effect. Conversely, other studies have shown that pharmacological inhibition of PDE2A counteracts the hypertrophic growth of cardiomyocytes. The aim of this study was to investigate the role of PDE2A in heart function under physiological and pathophysiological conditions using a heart-specific PDE2A knockout model. Furthermore, the goal was to elucidate the PDE2A-mediated cGMP/cAMP crosstalk mechanism using C-type natriuretic peptide (CNP) in freshly isolated murine cardiomyocytes and human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells (hiPSC-CMs) to uncover potential anti-arrhythmic cardioprotective effects of cGMP-mediated PDE2A stimulation. First, a new mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of PDE2A (PDE2A-KO) was generated using the 'knockout-first' strategy and characterized via echocardiography. The absence of PDE2A expression in cardiomyocytes did not lead to an altered cardiac phenotype under physiological conditions. However, under chronic stress conditions following isoprenaline infusion (osmotic minipump, 14 days), PDE2A-KO mice showed reduced contraction and ejection fraction compared to treated control animals. Heart rate and hypertrophy did not differ between the groups. To investigate the influence of CNP-mediated PDE2A activation on pro-arrhythmic intracellular signals, spontaneous local Ca2+ releases from the sarcoplasmic reticulum (Ca2+ sparks, CaSp), arrhythmic Ca2+ waves (CaW), and contraction of isolated ventricular and atrial cardiomyocytes were quantified. Interestingly, CNP significantly reduced the number of arrhythmogenic CaSp and CaW following acute β-adrenergic stimulation without affecting cellular contractility. This anti-arrhythmic effect was not observed in PDE2A-KO animals and was completely abolished by specific PDE2A inhibition with Bay 60-7550. Simultaneous inhibition of cGMP-activated protein kinase G had no effect on the number of CaSp. Additionally, experiments with isolated cardiomyocytes from mice with heart-specific PDE2A3 overexpression showed a significantly reduced number of CaSp after acute β-adrenergic stimulation. This protective effect was prevented by specific PDE2A inhibition. While PDE2A inhibition alone had no effect on CaSp frequency, inhibition of PDE3 and PDE4 significantly increased CaSp frequency in cardiomyocytes from control animals. Notably, the CNP/cGMP/PDE2A-mediated anti-arrhythmic effect was also reproduced in human ventricular and atrial iPSC-CMs. At the cellular level, stress-induced Ca2+ leaks in human cells were suppressed by CNP-mediated PDE2A stimulation. CNP mediated strong anti-arrhythmic effects at the cellular level through PDE2A stimulation. Interestingly, CNP expression in human ventricular tissue from HF patients was significantly reduced, while ANP and BNP were upregulated, potentially causing receptor desensitization. In isolated murine cardiomyocytes, CNP-mediated PDE2A activation significantly reduced intracellular cAMP levels. The findings from this study clearly underscore the clinical relevance of PDE2A as a potential therapeutic target for ventricular cardiac arrhythmias and atrial fibrillation following acute stress stimulation or in HF. In summary, this study demonstrated that PDE2A plays a crucial role in suppressing acute stress-induced arrhythmogenic Ca2+ leaks. Therefore, pharmacologically enhancing PDE2A activity could represent a novel cardioprotective strategy for treating arrhythmias in HF.
- Freie Schlagwörter (DE)
- PDE2A, Antiarrhythmika, CNP, Herz-Kreislauferkrankungen, Herzinsuffizienz
- Freie Schlagwörter (EN)
- PDE2A, antiarrhythmics, CNP, cardiovascular diseases, heart failure
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Klassifikation (RVK)
- YB 9204
- GutachterIn
- Prof. Dr. med. Ali El-Armouche
- Prof. Dr. rer. nat. Maximilian David Poitz
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- Version / Begutachtungsstatus
- publizierte Version / Verlagsversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-944267
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 12.12.2024
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XII Tabellenverzeichnis XVI 1. Einleitung 1 1.1. Herzinsuffizienz und kardiale Arrhythmien 1 1.1.1. Ätiologie und Epidemiologie 1 1.1.2. Pathophysiologie und Klassifikation kardialer Arrhythmien bei HF 3 1.1.3. Zellulärer und molekularer Aspekt 7 1.1.4. Pharmakologische Therapie 9 1.2. Kardiale Signaltransduktion und sekundäre Botenstoffe 11 1.2.1. cAMP-Signalkaskade 12 1.2.2. cGMP-Signalkaskade 13 1.2.3. Natriuretische Peptide und deren klinische Relevanz 14 1.3. Kardiale Phosphodiesterasen 15 1.3.1. Kardiale PDEs mit dualer Substratspezifität 17 1.3.2. Kardiale cAMP und cGMP-spezifische PDEs 18 1.4. Phosphodiesterase 2A 19 1.4.1. Molekularer Aspekt 19 1.4.2. PDE2A-Expression und Aktivität 21 1.4.3. Perspektiven hinsichtlich der Rolle von PDE2A bei Herzerkrankungen 22 2. Zielsetzung 24 3. Material und Methoden 25 3.1. Material 25 3.2. Tiermodel 25 3.2.1. Tierhaltung 25 3.2.2. C57BL/6JRj Wildtyp-Mausmodel 25 3.2.3. Herzspezifische PDE2A-KO-Mausmodel (PDE2A_fl_αMHC_cre) 26 3.2.4. Genotypisierung 27 3.3. Zellkultur und Differenzierung der humanen induced pluripotent stem cell-derived Kardiomyzyten (iPSC-KM) 30 3.4. Gewinnung Patientengewebe 31 3.5. Echokardiografische Langzeitcharakterisierung 32 3.6. Implantierung osmotischer Minipumpen 34 3.7. Zellisolation adulter Mauskardiomyozyten 35 3.7.1. Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten 35 3.7.2. Isolierung atrialer Kardiomyozyten 36 3.8. Kontraktilitätsmessung 37 3.9. Calcium-Imaging 38 3.10. Calcium-Spark Detektion in Kardiomyozyten 41 3.10.1. Calcium-Spark Detektion in Mauskardiomyozyten 41 3.10.2. Calcium-Spark Detektion in humanen iPSC-KM 42 3.11. Proteinexpressionsanalyse aus Mausatrium 42 3.11.1. Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung 42 3.11.2. Immunoblot 43 3.12. ELISA 45 3.13. qPCR 45 3.14. Statistische Auswertung 46 4. Ergebnisse 47 4.1. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die Herzfunktion 47 4.1.1. Echokardiografische Charakterisierung im Alter von 3 und 6 Monaten 47 4.1.2. Auswirkung einer chronischen Aktivierung der β-adrenergen Signalkaskade auf die Herzfunktion 51 4.2. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt in PDE2A-Knockout-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 56 4.2.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 56 4.2.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 60 4.2.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 63 4.3. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die Kontraktilität ventrikulärer Kardiomyozyten 65 4.3.1. Einfluss auf die zelluläre Kontraktion 65 4.3.2. Einfluss auf die zelluläre Kontraktionsgeschwindigkeit und Relaxationsgeschwindigkeit 67 4.3.3. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die zelluläre Kontraktion 69 4.4. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch natriuretische Peptide auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in ventrikulären Kardiomyozyten nach Stressinduktion 72 4.4.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 72 4.4.2. Veränderung der Spark-Morphologie nach CNP-Stimulation 73 4.4.3. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach ANP-Stimulation 75 4.4.4. Veränderung der Spark-Morphologie nach ANP 76 4.4.5. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz nach PKG-Inhibition 78 4.4.6. Veränderung der auf Spark-Morphologie nach PGK-Inhibition 80 4.5. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die intrazellulären cAMP-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten 82 4.6. Auswirkung des Myokardinfarkts auf die murine Genexpression der PDE2A, des CNP und der natriuretischen Peptidrezeptoren 83 4.7. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt atrialer Kardiomyozyten nach Stressinduktion 84 4.7.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 84 4.7.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 87 4.7.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 89 4.7.4. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf den Ca2+- Zyklus 90 4.8. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in atrialen Kardiomyozyten 95 4.8.1. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz 95 4.8.2. Veränderung der Spark-Morphologie 96 4.9. Auswirkung des PDE2A-KO auf die Expression Ca2+-regulierender Proteine 98 4.10. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in humanen iPSC-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 102 4.10.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 102 4.10.2. Auswirkung der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie 104 4.10.3. Bedeutung der PDE3 und PDE4 Inhibition auf Ca2+-Sparks in ventrikulären hiPSC-KM 106 4.10.4. Einfluss der PDE3 und PDE4 Inhibition auf die Ca2+-Spark-Morphologie 108 4.10.5. Bedeutung der CNP-Stimulation auf Ca2+-Sparks in atrialen hiPSC-KM nach Stressinduktion 109 4.10.6. Einfluss der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie nach Stressinduktion 111 4.11. Auswirkung dilatativer Kardiomyopathie auf die Genexpression natriuretischer Peptide und deren Rezeptoren 112 5. Diskussion 114 5.1. Der herzspezifische PDE2A-Knockout 115 5.1.1. Basale Herzfunktion konditionaler PDE2A-KO Mäuse 115 5.1.2. Cre-Expression beeinträchtigt die Überlebensfähigkeit der PDE2A-KO Mäuse 116 5.1.3. Der PDE2A-KO führt zur Reduktion der Herzfunktion bei chronischer Stressstimulation 117 5.2. Die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation reduziert arrhythmogene Ca2+-Freisetzungen ohne den intrazellulären Ca2+-Zyklus oder die zelluläre Kontraktion zu beeinflussen 119 5.2.1. PDE2A-Stimulation reduziert stressinduzierte arrhythmogene Ca2+-Wellen 119 5.2.2. Die zelluläre Kontraktilität wird durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation nicht beeinträchtigt 121 5.2.3. Natriuretische Peptid-vermittelte PDE2A-Stimualtion unterdrückt die stressinduzierten Ca2+-Lecks aus dem SR 122 5.3. CNP vermittelt einen anti-arrhythmogenen Effekt in humanen iPSC-Kardiomyozyten 124 5.4. Limitationen 125 5.4.1. Einschränkungen des Cre/loxP-Systems beim PDE2A-KO 125 5.4.2. Crosstalk-Mechanismen zyklischer Nukleotide 126 5.4.3. Patientenbasierte Variabilität 127 5.5. Ausblick 128 5.6. Die klinische Relevanz der PDE2A 129 6. Zusammenfassung 131 7. Summary 133 8. Referenzen 135 9. Anhang 162 9.1. Chemikalienliste 162 9.2. Antikörper- und Primerliste 164 9.3. Kits und Verbrauchsmaterialien 166 10. Danksagung 172 11. Erklärung 173