- Titel
- Scale-up dynamischer Perfusionsbioreaktorsysteme für das Tissue Engineering von Knochen
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-943936
- Übersetzter Titel (EN)
- Scale-up of dynamic perfusion bioreactor systems for bone tissue engineering
- Erstveröffentlichung
- 2024
- Datum der Einreichung
- 21.07.2023
- Datum der Verteidigung
- 14.12.2023
- Abstract (DE)
- Aufgrund der steigenden Lebenserwartung und des damit verbundenen demographischen Wandels sind muskuloskelettale Erkrankungen, die mit lokalisierten Knochendefekten einhergehen, der zweithäufigste Faktor für funktionelle Einschränkungen und wirtschaftliche Belastungen der nationalen Gesundheitssysteme (Vos et al., 2017). Traumata, Infektionen, Tumore, angeborene Fehlbildungen und degenerative Erkrankungen können zu sogenannten kritischen Knochendefekten führen, die eine Behandlung mittels autologer Knochentransplantation erforderlich machen (Gómez-Barrena et al., 2015). Der dabei entstehende Entnahmedefekt und der zusätzliche chirurgische Eingriff erhöhen das Risiko für anhaltende Schmerzen, Nervenverletzungen, Frakturen und Infektionen. Die Züchtung von künstlichem Gewebe (Tissue Engineering) ist ein vielversprechender alternativer Ansatz zur dauerhaften Heilung von Gewebedefekten. Mesenchymale Stammzellen (engl.: mesenchymal stem cells - MSC), die auf ein künstliches Gerüst aufgebracht werden, sind in der Lage, sich ex vivo vermehrt zu teilen und sich in das entsprechende Gewebe zu entwickeln, wenn sie einem biochemischen oder mechanischen Differenzierungsreiz ausgesetzt werden (Caplan und Bruder, 2001; Caetano-Silva et al., 2019). Voraussetzung für die Anwendung im klinischen Kontext ist die Verwendung großformatiger Scaffolds. Eines der Hauptziele dieser Studie war es, die Auswirkungen dynamischer in vitro Besiedlungsmethoden auf die Besiedlungseffizienz und die Zellverteilung zu untersuchen. Dynamische Perfusions- und Rotationskolonisation wurden mit statischer Kolonisation verglichen. Aufgrund des hohen Scaffoldvolumens nimmt die Bedeutung der initialen Zelldichte für die Zellverteilung und Besiedlungseffizienz zu. Bei vergleichsweise geringen Ausgangszelldichten 0,8 ∙ 106 Zellen / cm3 konnte eine um bis zu 32 % verbesserte Besiedlungseffizienz durch dynamische Verfahren im Vergleich zu statischen Verfahren gezeigt werden. Jede Besiedlungsmethode zeigte eine unterschiedliche räumliche Verteilung der hTERT-MSC auf den BCB- und β-TCP-Scaffolds in Abhängigkeit von der verwendeten Scaffoldstruktur. Die rotierende Besiedlung erwies sich für beide Scaffolds als vorteilhaft. Es wurde ein universelles Protokoll für die effiziente und teilautomatisierte Besiedlung großer Scaffolds entwickelt. Neben verschiedenen Kultivierungsverfahren (Rauh et al., 2011) ermöglicht die Durchströmung des Scaffolds im Perfusionsbioreaktor die Versorgung und Stimulation der mesenchymalen Zellen in osteogener Richtung (Ando et al., 1988) und den Abtransport toxischer Nebenprodukte. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Bioreaktorsystem (Milan, 2010) optimiert, das die Herstellung großflächiger Implantate aus autologen Zellen für die Knochenregeneration ermöglicht. Eine gezwungene Perfusion direkt durch das Knochengerüst sorgte für eine gleichmäßige Versorgung der MSC im gesamten Gerüst, die mit Sauerstoffsensoren online verfolgt wurde. Die kontinuierliche Sauerstoffmessung im Zentrum der statisch kultivierten Scaffolds diente als Prozessleitparameter und zeigte bereits am Tag 6 eine Unterversorgung bei einem Sauerstoffgehalt von 1% an. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten am Tag 14 deutlich nekrotische Zonen im Inneren des Scaffolds, die aus der Sauerstoffunterversorgung resultierten. Im Gegensatz dazu wurde im Perfusionsbioreaktorsystem ein normoxischer Sauerstoffgehalt von 20 % aufrechterhalten. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten nach 14 Tagen dynamischer Perfusionskultur ausschließlich vitale Zellen. Diese Einführung eines Leitparameters und die Anpassung des Perfusionsbioreaktorsystems sind wichtige Voraussetzungen für die Skalierung des Tissue Engineering von Knochen in klinisch relevante Scaffoldgrößen. Die Segmentierung der Proben ermöglichte neben der Untersuchung der Zellverteilung auch die Untersuchung der Genexpression und der osteogenen Differenzierung der MSC. Im Vergleich zur statischen Kultur zeigte die dynamische Kultur eine Tendenz zu einer stärkeren osteogenen Differenzierung (66 %). Gleichzeitig war die Zellzahl mit 63 % signifikant niedriger. Die parallele Verwendung kleinerer Scaffolds ermöglicht die Untersuchung geeigneter Randbedingungen, verschiedener Zelltypen und die Optimierung der Prozessparameter bei geringerem Materialeinsatz. So konnte gezeigt werden, dass der Einfluss der Perfusionsrate vom verwendeten Zelltyp abhängt. Dabei profitieren robustere Zellpopulationen von höheren Perfusionsraten, während mittlere Perfusionsraten universell eingesetzt werden können. Auch eine Abhängigkeit von der Zelldichte konnte beobachtet werden. Dies legt eine gezielte Anpassung des Perfusionsregimes in Abhängigkeit vom Wachstums- und Differenzierungsstadium der MSC nahe. Aktuelle Studien zeigen, dass eine Vorhersage der optimalen Prozessparameter mit Hilfe von Simulationen möglich und sinnvoll ist (McCoy und O’Brien, 2012; Zhao et al., 2019). Die Herstellung komplexerer oder gar individualisierter Scaffolds ist eine wichtige Voraussetzung für die Translation in die klinische Anwendung. In einem Proof of Concept konnte gezeigt werden, dass 3D-gedruckte Strukturen mit dem Perfusionssystem erfolgreich kultiviert werden können. Die Co-Kultivierung von Knochenvorläuferzellen zusammen mit vaskulären Vorläuferzellen zeigt positive Tendenzen zu einer verbesserten Proliferation und Differenzierung. Durch Optimierung der Prozessparameter sind hier weitere Verbesserungen zu erwarten. Ein optimiertes Protokoll ermöglichte die effiziente Zellbesiedlung von groß dimensionierten Scaffolds. Das speziell für diese Dimensionen konzipierte Bioreaktorsystem gewährleistete eine konstante Versorgung der MSC auch innerhalb des Scaffolds. Durch die kontinuierliche Messung des Sauerstoffgehaltes wurde ein Leitparameter etabliert, der durch eine optimierte Endpunktanalyse validiert wurde. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden und Werkzeuge ermöglichen die Kultivierung von vitalem Knochenersatzmaterial in klinisch relevanten Größen.
- Abstract (EN)
- Due to increasing life expectancy and the associated demographic change, disorders of the musculoskeletal system associated with localized bone defects are the second most common factor for functional limitations and economic burdens on national healthcare systems (Vos et al., 2017). Trauma, infection, tumors, congenital malformations and degenerative diseases can lead to so-called critical bone defects that require treatment by autologous bone grafting (Gómez-Barrena et al., 2015). The resulting harvesting defect and the additional surgery increase the risk of persistent pain, nerve injury, fractures and infection. The cultivation of artificial tissue (tissue engineering) is a promising alternative concept for the sustainable healing of tissue defects. Mesenchymal stem cells (MSCs) applied to an artificial structure are capable of dividing to a greater extent ex vivo and developing into the corresponding tissue when exposed to a biochemical or mechanical differentiation stimulus (Caplan and Bruder, 2001; Caetano-Silva et al., 2019) The use of large-scale scaffolds is a prerequisite for their application in a clinical context. One of the primary objectives of this study was to investigate the effects of dynamic in vitro colonisation methods on colonisation efficiency and cell distribution. Dynamic perfusion and rotational colonisation were compared to static colonisation. Due to the high scaffold volume, the importance of the initial cell density for cell distribution and colonisation efficiency increases. At a comparatively low initial cell density of 0,8 ∙ 106 cells / cm3, dynamic methods showed an improvement in colonisation efficiency of up to 32% compared to static methods. Each colonisation method showed a different spatial distribution of hTERT-MSCs on the BCB and β-TCP scaffolds, depending on the scaffold structure used. Rotational colonisation proved advantageous for both scaffolds. A universal protocol for efficient and semi-automated colonisation of large scaffolds was developed. In addition to various cultivation methods (Rauh et al., 2011), the flow through the scaffold in the perfusion bioreactor allows the supply and stimulation of mesenchymal cells in the osteogenic direction (Ando et al., 1988) and the removal of toxic by-products. In the present study, a bioreactor system (Milan, 2010) was optimised for the production of large-area implants from autologous cells for bone regeneration. Forced perfusion directly through the bone scaffold ensured a uniform oxygen supply to the MSCs throughout the scaffold, which was monitored online using oxygen sensors. Continuous oxygen measurement in the centre of the statically cultured scaffolds served as a process control parameter and indicated an undersupply at an oxygen content of 1% as early as day 6. Fluorescence microscopy on day 14 clearly showed necrotic zones inside the scaffold resulting from the oxygen deficiency. In contrast, a normoxic oxygen level of 20% was maintained in the perfusion bioreactor system. Fluorescence microscopy revealed only viable cells after 14 days of dynamic perfusion culture. The introduction of a control parameter and the adaptation of the perfusion bioreactor system are important prerequisites for scaling up bone tissue engineering to clinically relevant scaffold sizes. The segmentation of the samples allowed the study of gene expression and osteogenic differentiation of the MSC in parallel with the study of cell distribution. Compared to static culture, dynamic culture showed a 66% trend towards greater osteogenic differentiation. At the same time, the cell count was significantly lower by 63%. The parallel use of smaller scaffolds allows the investigation of suitable boundary conditions, different cell types and the optimisation of process parameters with less material input. It has been shown that the influence of the perfusion rate depends on the cell type used. More robust cell populations benefit from higher perfusion rates, while medium perfusion rates can be used universally. A dependence on cell density was also observed. This suggests a targeted adaptation of the perfusion regime based on the growth and differentiation stage of the MSC. Recent studies show that it is possible and useful to predict the optimal process parameters using simulations (McCoy and O'Brien, 2012; Zhao et al., 2019). The production of more complex or even customised scaffolds is an important prerequisite for translation into clinical application. A proof-of-concept study has shown that 3D printed structures can be successfully cultured using the perfusion system. The co-culture of bone progenitor cells with vascular progenitor cells shows positive trends towards better proliferation and differentiation. Further increases can be expected with optimisation of the process parameters. An optimised protocol allowed efficient cell colonisation of large scaffolds. The bioreactor system, specially designed for these dimensions, ensured a constant supply of oxygen to the MSCs inside the scaffold. By continuously measuring the oxygen content, a control parameter was established and validated by an optimised endpoint analysis. The methods and tools described in this thesis enable the cultivation of vital bone substitute materials in clinically relevant sizes.
- Freie Schlagwörter (DE)
- Tissue Engineering, Scale-up, Bioreaktor, Perfusion
- Freie Schlagwörter (EN)
- Tissue Engineering, Scale-up, Bioreactor, Perfusion
- Klassifikation (DDC)
- 620
- Klassifikation (RVK)
- WF 9725
- GutachterIn
- Prof. Dr. Thomas Bley
- Prof. Dr. Michael Gelinsky
- Priv.-Doz. Dr. med. Dr. phil. Maik Stiehler
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- Version / Begutachtungsstatus
- publizierte Version / Verlagsversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-943936
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 19.12.2024
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
CC BY 4.0- Inhaltsverzeichnis
1 Motivation 2 Grundlagen 2.1 Knochen 2.1.1 Knochenaufbau 2.1.2 Knochenumbau und Knochenregeneration 2.1.3 Knochendefekte und Knochenheilung 2.1.4 Kritischer Knochendefekt 2.1.5 Therapieansätze zur Behandlung von Knochendefekten 2.2 Knochen-Tissue Engineering (TE) 2.2.1 Mesenchymale Stammzellen 2.2.2 Differenzierungsfaktoren 2.2.3 Scaffolds für die Knochenregeneration 2.2.4 Vaskularisierung kritischer Knochendefekte 2.3 Bioreaktoren zur dynamischen Kultivierung von Knochengewebe 2.3.1 Strömungsbasierte Systeme 2.3.2 Weitere Bioreaktorsysteme 3 Material und Methoden 3.1 Materialien, Geräte und Software 3.1.1 Scaffolds 3.1.2 Geräte und Software 3.1.3 Werkstoffe 3.1.4 Verwendete Bioreaktoren 3.1.5 Sauerstoffsensor 3.1.6 Schneidevorrichtung 3.2 Zellkulturtechniken 3.2.1 Zellkulturmedien 3.2.2 Zelltypen 3.2.3 Kultivierung von MSC 3.3 Versuchsaufbau 3.3.1 Optimierung der Besiedlungsmethode 3.3.2 Theoretische Ermittlung der optimalen Durchflussgeschwindigkeit 3.3.3 Funktionstest Bioreaktor 3.3.4 Optimale Durchflussrate für große Scaffolds 3.3.5 Optimale Durchflussrate für kleine Scaffolds 3.3.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 3.4 Zellquantifizierung und -differenzierung 3.4.1 Direkte Bestimmung der Zellzahl und der Besiedlungseffizienz 3.4.2 Quantifizierung der DNA 3.4.3 Bestimmung der LDH-Aktivität 3.4.4 Nachweis der osteogenen Differenzierung 3.4.5 Quantitative real-time PCR Analyse 3.5 Mikroskopie 3.5.1 Histologische Untersuchung der besiedelten Spongiosa 3.5.2 Live/Dead-Färbung 3.5.3 Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der Zellverteilung im Scaffold 4 Versuchsergebnisse 4.1 Visualisierung und Analyse von großen TE-Konstrukten 4.1.1 Sauerstoffmessung 4.1.2 Segmentierung der Proben 4.2 Optimierung Bioreaktorsystem 4.2.1 Überarbeitung Bioreaktorkammer 4.2.2 Teilautomatisierung Bioreaktorsystem 4.3 Besiedlungsmethoden für große TE-Konstrukte 4.3.1 Adhärenz 4.3.2 Besiedlungseffizienz 4.3.3 Zellverteilung 4.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 4.4.1 Verteilung und Vitalität 4.4.2 Sauerstoffgehalt 4.4.3 Zellwachstum und Differenzierung 4.5 Bestimmung der optimalen Strömungsgeschwindigkeit 4.5.1 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 4.5.2 Simulation 4.5.3 Optimale Durchflussrate für große TCP-Scaffolds 4.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 4.6.1 Zellverteilung, -vitalität und -adhärenz 4.6.2 Zellzahl 4.6.3 Sauerstoffkonzentration 5 Diskussion 5.1 Zellexpansion von MSC mit Hilfe von Bioreaktoren 5.2 Besiedlung verschiedener Scaffoldstrukturen 5.2.1 Besiedlungsmethode 5.2.2 Initiale Zelldichte 5.2.3 Zellverteilung 5.2.4 Besiedlungseffizienz 5.2.5 Scaffoldstruktur 5.2.6 Verhältnis Suspensionsvolumen zu Porosität 5.3 Perfusionsbioreaktoren für die Herstellung von Tissue Engineering Konstrukten 5.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 5.4.1 Technische Herausforderungen 5.5 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 5.5.1 Scale-up der Scaffoldstruktur 5.5.2 Parameter in Perfusionsbioreaktorsystemen 5.5.3 Vergleich von Versuchsparametern 5.5.4 Identifikation von Leitparametern 5.5.5 Simulation für präzise Parametervorhersage 5.5.6 Regelung von Prozessparametern 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Bilderverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis