- Titel
- Untersuchung von NK‑Zell-Migration und Radioresistenz gegenüber Protonenstrahlung an 3D-Cokulturen von Pankreaskarzinomzellen und pankreatischen Sternzellen
- Zitierfähige Url:
- https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-1048389
- Erstveröffentlichung
- 2026
- Datum der Einreichung
- 17.12.2025
- Datum der Verteidigung
- 12.05.2026
- Abstract (DE)
- Hintergrund: Das pankreatische duktale Adenokarzinom (PDAC) stellt die häufigste maligne Erkrankung des Pankreas dar und ist u.a. durch eine hohe Letalität und schlechtes Therapieansprechen gekennzeichnet. Derzeit existiert neben der chirurgischen Resektion bei nicht-metastasierten Tumoren keine weitere kurative Therapie. Konventionelle Strahlentherapie spielt aufgrund der Nähe zu strahlensensiblen Organen bislang eine untergeordnete Rolle. Protonenbestrahlung ermöglicht dank ihres vorteilhaften inversen Tiefendosisprofils eine präzisere Bestrahlung von Tumoren unter Schonung von umliegendem Gewebe und stellt dabei eine potentielle alternative Therapieoption dar. Charakteristisch für das PDAC ist ein stark überhöhter Anteil an bindegewebigem Stroma, welches vorrangig durch pankreatische Sternzellen (PSC) gebildet wird und eine effektive Barriere gegen systemische Therapeutika und die Einwanderung von Immunzellen darstellt. Aktivierte PSC beeinflussen zudem Wachstum, Proliferation und Migration von PDAC-Zellen und können deren Chemoresistenz erhöhen. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind eine lymphozytäre Subpopulation und spielen eine wichtige Rolle in der körpereigenen Immunantwort gegen virusinfizierte und entartete Zellen. Sie gewinnen zunehmend an Bedeutung im Rahmen adoptiver Zelltherapien und werden in diesem Kontext häufig labortechnisch mit einem chimären Antigenrezeptor (CAR) ausgestattet. Dieser befähigt die CAR-tragende NK-Zelle zur Erkennung eines spezifischen Antigens auf der Oberfläche von Tumorzellen und kann deren antitumorale Aktivität steigern. Fragestellung / Hypothese: In der vorliegenden Arbeit sollte die Möglichkeit einer gegen EGFR gerichteten (CAR)-NKZelltherapie nach Protonenbestrahlung zur Behandlung von PDAC präklinisch in einem dreidimensionalen in-vitro Modellsystem getestet werden. Auf Basis der Tumorzell-EGFRExpression war ein PDAC-Zelllinienmodell zur Herstellung multizellulärer Tumorsphäroide auszuwählen und Sphäroid-Cokultur-Ansätze mit PSC zu etablieren. Anhand dieser war zu prüfen, ob die Anwesenheit von PSC die Resistenz der PDAC-Zellen gegenüber Protonenbestrahlung erhöht und ob die Protonenbestrahlung die Tumorzell-EGFR-Expression möglicherweise zugunsten eines EGFR-Targetings verändert. In Folge war zu klären, ob ein Monitoring der NK-Zellinfiltration in PDAC-Sphäroide möglich ist und welche der folgenden Faktoren die NK-Zellinfiltration des PDAC-Gewebemodells beeinflussen: (i) die Implementierung eines gegen EGFR gerichteten CAR, (ii) die Anwesenheit von PSC, (iii) eine der potenziellen CAR-NK-Zelltherapie vorgeschaltete Protonenbestrahlung des PDACGewebes. Material und Methoden: Zum Einsatz kamen zunächst verschiedene humane PDAC-Zelllinien, deren EGFRExpression anhand von Immunfluoreszenzfärbung mithilfe des EGFR-Antikörpers Cetuximab und anschließender Durchflusszytometrie quantifiziert wurde. Dies führte zu einer Fokussierung auf das EGFR-positive Zelllinienmodell PANC-1 in weiterführenden systematischen Experimenten. Zur Sphäroidkultivierung wurde ein modifiziertes liquid overlay Verfahren auf Basis Agarosebeschichteter 96-well Platten genutzt, wobei sowohl PANC-1-Monokultur- auch PANC-1- hPSC-Cokultur-Sphäroide generiert wurden. In einem 60-Tage Sphäroidkontrollwahrscheinlichkeits-Assay (SCP-Assay) wurden diese hinsichtlich ihrer Radioresistenz gegenüber Protonenbestrahlung untersucht unter Berechnung der Sphäroidkontrolldosis 50% (SCD50). Alle Bestrahlungen erfolgten in vertikaler Positionierung der 96-well-Platten zum Protonenstrahl im Experimentalraum der UniversitätsProtonenTherapie Dresden. Hierzu waren die Kulturplatten luftdicht mit Folien zu verschießen und ein spezielles, sorgfältiges Handling einzuhalten, um die Sphäroide nicht durch das experimentelle Prozedere im Voraus zu schädigen. Im Rahmen von Sphäroid-Immunzell-Infiltrationsstudien kamen die fluoreszenten NKZelllinien YTS-DAP12-EGFP (abgekürzt YTS) und YTS-scFv(EGFR)-DAP12-Puro+EGFP (abgekürzt YTS-EGFR) in Suspensionskultur zum Einsatz. Zur Analyse der infiltrierten NKZellen wurden die Sphäroide nach definierten Zeiten der NK-Zell-Exposition mehrfach gewaschen, zu Einzelzellsuspensionen dissoziiert, die Zellzahl bestimmt und anschließend der Anteil an NK-Zellen durchflusszytometrisch ermittelt. Hierbei wurde neben dem Anteil an NK-Zellen in der gewonnenen Sphäroid-Zellsuspension auch der Anteil migrierter NK-Zellen bezogen auf die ursprüngliche Anzahl an zugegebenen NK-Zellen berechnet. Es wurde sowohl die zugegebene NK-Zellzahl pro Sphäroid (5.000 – 80.000) als auch die Expositionszeit (1 – 16 h) variiert. Ergebnisse: Die durchflusszytometrische Untersuchung der EGFR-Expression erbrachte, dass • PANC-1-Zellen eine moderate, im Vergleich zu anderen PDAC-Zelllinien relativ hohe EGFR-Expression aufweisen. • PANC-1-Zellen aus Sphäroidkulturen keine veränderte EGFR-Expression als PANC1-Zellen aus Monolayerkulturen zeigen. • hPSC eine nur minimale EGFR-Expression besitzen. • Protonenbestrahlung einen vorübergehenden Anstieg der EGFR-Expression in PANC1-Sphäroiden 24 h nach Bestrahlung bewirkt. Die experimentellen Ansätze zur vergleichenden Analyse der PANC1-Mono- versus PANC-1- hPSC-Cokultursphäroide zeigen: • PANC-1-hPSC-Cokultur-Sphäroide weisen eine höhere Zelldichte und Wachstumsrate als PANC‑1-Monokultur-Sphäroide auf. • PANC-1-hPSC-Cokultur-Sphäroide besitzen keine höhere Strahlenresistenz gegenüber Protonenbestrahlung als PANC‑1-Monokultur-Sphäroide. Im Rahmen der NK-Zell-Infiltrationsstudien sind folgende Beobachtungen von zentraler Bedeutung: • Die NK-Zell-Infiltration der Sphäroide ist nach 6 h abgeschlossen. • Das Maximum der Fraktion migrierter NK-Zellen von 1,5 − 2 % liegt bei einer zugegebenen NK-Zellzahl von 20.000. Bei Einsatz von NK-Zellzahlen darüber hinaus fällt die Fraktion migrierter NK-Zellen erneut ab. • Die Implementierung eines gegen EGFR-gerichteten CAR erhöht deutlich die NKZellinfiltration von PANC1-Sphräoiden auf eine Fraktion migrierter NK-Zellen von 5 − 10%. • Eine Cokultivierung mit hPSC hat keinen signifikanten Einfluss auf die NK-ZellInfiltration von PANC-1-Sphäroiden. • Protonenbestrahlte PANC‑1-Sphäroide wiesen nach NK-Zell-Inkubation einen höheren NK-Zell-Anteil auf als unbestrahlte Sphäroide ohne Erhöhung der Fraktion migrierter NK-Zellen. • Eine Zugabe von NK-Zellen zum Zeitpunkt der höchsten EGFR-Expression bewirkt keine signifikant gesteigerte NK-Zell-Migration in PANC-1-Sphäroide. Schlussfolgerungen: Es konnte erfolgreich ein komplexes Cokulturmodell aus PDAC-Tumorzellen, Fibroblasten und Immunzellen etabliert und charakterisiert werden. Angesichts der gezeigten deutlichen Steigerung der NK-Zellmigration in PDAC-Sphäroide durch Implementierung eines EGFRspezifischen CAR ist eine Weiterführung der Studien sinnvoll. Aufgrund der jedoch weiterhin geringen NK-Zellinfiltration, die möglicherweise durch die nur moderate EGFR-Expression der PDAC-Zellen bedingt ist, sollten auch andere bzw. zusätzliche CAR-Zielstrukturen in Betracht gezogen werden. Eine geringfügig gesteigerte Expressionssteigerung der Zielstruktur wie in dieser Arbeit durch Protonenbestrahlung induziert führt nicht zwangsläufig zu einer Steigerung der NK-Zell-Infiltration. Zur Verifikation der Beobachtungen sollten noch andere PDACZellmodelle genutzt und weitere analytische Endpunkte einbezogen werden, insbesondere zur Evaluation der NK-Zell-Zytotoxizität.
- Abstract (EN)
- Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the most common malignant disease of the pancreas and is characterized, among other features, by high lethality and poor therapeutic response. Apart from surgical resection in non-metastatic tumors, no further curative treatment options currently exist. Conventional radiotherapy has played only a minor role to date due to the close proximity to radiosensitive organs. Owing to its favorable inverse depth–dose profile, proton therapy enables more precise irradiation of tumors while sparing surrounding tissues and therefore represents a potential alternative therapeutic approach. A characteristic of PDAC is a markedly increased proportion of fibrotic stroma, which is primarily formed by pancreatic stellate cells (PSC) and constitutes an effective barrier against systemic therapeutics as well as immune cell infiltration. Activated PSC additionally influence growth, proliferation, and migration of PDAC cells and may enhance their chemoresistance. Natural killer cells (NK cells) are a subpopulation of lymphocytes and play a crucial role in the endogenous immune response against virus-infected and malignant cells. They are gaining increasing importance in the context of adoptive cell therapies and are often genetically engineered to express a chimeric antigen receptor (CAR). This receptor enables CAR-NK cells to recognize a specific antigen on the surface of tumor cells and can enhance their antitumor activity. Research question / hypothesis: The aim of this study was to preclinically evaluate the feasibility of an epidermal growth factor receptor (EGFR)–directed CAR-NK cell therapy following proton irradiation for the treatment of PDAC using a three-dimensional in vitro model system. Based on tumor cell EGFR expression, a PDAC cell line model was to be selected for the generation of multicellular tumor spheroids, and spheroid coculture systems with PSC were to be established. Using these models, it was investigated whether the presence of PSC increases PDAC cell resistance to proton irradiation and whether proton irradiation alters tumor cell EGFR expression in favor of EGFR targeting. Subsequently, it was assessed whether monitoring NK cell infiltration into PDAC spheroids is feasible and which of the following factors influence NK cell infiltration into the PDAC tissue model: (i) implementation of an EGFR-directed CAR, (ii) presence of PSCs, and (iii) proton irradiation of the PDAC tissue prior to potential CAR-NK cell therapy. Materials and Methods: Initially, various human PDAC cell lines were employed, and their EGFR expression was quantified by immunofluorescence staining using the EGFR antibody cetuximab followed by flow cytometry. This led to a focus on the EGFR-positive PANC-1 cell line model for further systematic experiments. For spheroid cultivation, a modified liquid overlay method based on agarose-coated 96-well plates was used, generating both PANC-1 monoculture spheroids and PANC-1–hPSC coculture spheroids. These spheroids were analyzed for their radioresistance to proton irradiation in a 60-day spheroid control probability assay (SCP assay), with calculation of the spheroid control dose 50% (SCD50). All irradiations were performed with the 96-well plates positioned vertically relative to the proton beam in the experimental room of the UniversityProtonTherapy Dresden. For this purpose, culture plates were hermetically sealed with foil, and a specific, careful handling protocol was followed to prevent damage to the spheroids prior to irradiation. For spheroid immune cell infiltration studies, the fluorescent NK cell lines YTS-DAP12-EGFP (abbreviated YTS) and YTS-scFv(EGFR)-DAP12-Puro+EGFP (abbreviated YTS-EGFR) were used in suspension culture. To analyze infiltrated NK cells, spheroids were washed multiple times after defined NK cell exposure periods, dissociated into single-cell suspensions, counted, and subsequently analyzed by flow cytometry to determine the proportion of NK cells. In addition to the fraction of NK cells within the spheroid-derived cell suspension, the fraction of migrated NK cells relative to the initially applied NK cell number was calculated. Both number of NK cells added per spheroid (5.000–80.000) and exposure time (1–16 h) were varied. Results: Flow cytometric analysis of EGFR expression revealed that • PANC-1 cells exhibit moderate EGFR expression that is relatively high compared with other PDAC cell lines. • PANC-1 cells derived from spheroid cultures show no altered EGFR expression compared with PANC-1 cells from monolayer cultures. • hPSCs show only minimal EGFR expression. • proton irradiation induces a transient increase in EGFR expression in PANC-1 spheroids 24 h after irradiation. Comparative experimental analyses of PANC-1 monoculture versus PANC-1–hPSC coculture spheroids demonstrated that • PANC-1–hPSC coculture spheroids exhibit higher cell density and growth rates than PANC-1 monoculture spheroids. • PANC-1–hPSC coculture spheroids do not exhibit increased radioresistance to proton irradiation compared with PANC-1 monoculture spheroids. Within the NK cell infiltration studies, the following key observations were made: • NK cell infiltration of spheroids is completed after 6 h. • The maximum fraction of migrated NK cells (1.5–2%) occurs at an applied NK cell number of 20,000; at higher NK cell numbers, the fraction of migrated NK cells decreases again. • Implementation of an EGFR-directed CAR markedly increases NK cell infiltration into PANC-1 spheroids to a migrated NK cell fraction of 5–10%. • Cocultivation with hPSC has no significant effect on NK cell infiltration into PANC-1 spheroids. • Proton-irradiated PANC-1 spheroids exhibit a higher proportion of NK cells after NK cell incubation compared with non-irradiated spheroids, without an increase in the fraction of migrated NK cells. • Addition of NK cells at the time point of highest EGFR expression does not result in significantly enhanced NK cell migration into PANC-1 spheroids. Conclusions: A complex coculture model consisting of PDAC tumor cells, fibroblasts, and immune cells was successfully established and characterized. Given the demonstrated substantial increase in NK cell migration into PDAC spheroids upon implementation of an EGFR-specific CAR, further investigation of this approach is warranted. However, due to the persistently low overall NK cell infiltration - potentially attributable to the only moderate EGFR expression of PDAC cells - alternative and/or additional CAR target structures should be considered. A modest irradiationinduced increase in target antigen expression, as observed in this study following proton irradiation, does not necessarily lead to enhanced NK cell infiltration. To validate these observations, additional PDAC cell models should be employed and further analytical endpoints included, particularly for the evaluation of NK cell cytotoxicity.
- Freie Schlagwörter (DE)
- Pankreaskarzinom, CAR, pankreatische Sternzellen, Protonenbestrahlung, PDAC
- Freie Schlagwörter (EN)
- Pancreatic cancer, CAR, pancreatic stellate cells, proton therapy, PDAC
- Klassifikation (DDC)
- 610
- Klassifikation (RVK)
- XH 7504
- GutachterIn
- Prof. Dr. Leoni Kunz-Schughart
- Prof. Dr. Achim Temme
- Den akademischen Grad verleihende / prüfende Institution
- Technische Universität Dresden, Dresden
- Version / Begutachtungsstatus
- publizierte Version / Verlagsversion
- URN Qucosa
- urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-1048389
- Veröffentlichungsdatum Qucosa
- 06.07.2026
- Dokumenttyp
- Dissertation
- Sprache des Dokumentes
- Deutsch
- Lizenz / Rechtehinweis
- Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis xi Abbildungsverzeichnis xv Tabellenverzeichnis i 1 Einleitung 1 1.1 Das Pankreas 1 1.1.1 Allgemeines 1 1.1.2 Pankreatische Sternzellen 3 1.1.3 Das pankreatische duktale Adenokarzinom 5 1.2 NK-Zellen 7 1.2.1 Allgemeine Physiologie der NK-Zelle 7 1.2.2 NK-Zellen in der Onkologie 10 1.3 Chimäre Antigenrezeptoren 11 1.4 Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 13 1.5 Protonenbestrahlung 14 1.6 Sphäroide als experimentelles Tumormodell 15 1.7 Motivation und Aufgabenstellung 16 2 Material und Methoden 18 2.1 Materialien 18 2.1.1 Geräte 18 2.1.2 Software 19 2.1.3 Verbrauchsmaterialien 19 2.1.4 Chemikalien und Reagenzien 20 2.1.5 Manuell hergestellte Lösungen 22 2.1.6 Verwendete Antikörper 23 2.1.7 Verwendete Zellen 23 2.1.7.1 Adhärente Zellen 24 2.1.7.1.1 Pankreas 24 2.1.7.1.2 Sonstige Entitäten 25 2.1.7.2 NK-Zellen 25 2.2 Methoden 26 2.2.1 Zellkultivierung 26 2.2.1.1 Kultivierungsbedingungen 26 2.2.1.2 Konservierung und Rekultivierung 26 2.2.1.3 Monolayerkultivierung 27 2.2.1.4 Sphäroidkultivierung 28 2.2.1.5 Kultivierung von Suspensionskulturen 30 2.2.2 Sphäroidanalytik 31 2.2.2.1 Bildaufnahme und -auswertung 31 2.2.2.2 Dissoziation und Zellzahlbestimmung 32 2.2.2.3 Monitoring und Wachstumsanalyse 32 2.2.2.4 Sphäroidkontrollwahrscheinlichkeit und -kontrolldosis 33 2.2.3 Protonenbestrahlung 34 2.2.4 Inkubation mit NK-Zellen 36 2.2.5 Durchflusszytometrische Analysen 36 2.2.5.1 Immunfluoreszenzfärbung 36 2.2.5.2 Durchflusszytometrie 37 2.2.6 Statistik 39 3 Ergebnisse 41 3.1 Charakterisierung der verwendeten Zellmodelle 41 3.1.1 EGFR-Expression verschiedener PDAC-Zelllinien 41 3.1.2 Präzisierung der PANC-1/hPSC-Sphäroid-Modelle 44 3.1.3 Adaptation der NK-Zell-Modelle 47 3.2 Protonenbestrahlung von PANC-1-Mono- und -Cokultur-Sphäroiden 49 3.2.1 Radiosensitivität von PANC-1-Mono- und PANC-1-hPSC-Cokultur-Sphäroiden bei Protonenbestrahlung 49 3.2.2 Kurzzeitwirkung einer 8 Gy Protoneneinzeldosis auf die Sphäroidgröße von PANC-1-Sphäroiden 52 3.2.3 EGFR-Expression von PANC-1-Sphäroiden nach Protoneneinzelbestrahlung mit 8 Gy 53 3.3 NK-Zell-Migration in PANC-1-Sphäroide 54 3.3.1 Abhängigkeit der NK-Zell-Migration von der zugegebenen NK-Zellzahl 54 3.3.2 Zeitkinetik der NK-Zell-Migration 56 3.3.3 Einfluss von hPSC und EGFR-Targeting auf die NK-Zell-Migration 57 3.3.4 Einfluss von Protonenbestrahlung auf die NK-Zell-Migration 58 4 Diskussion 61 4.1 Diskussion der Materialien und Methoden 61 4.1.1 Multizelluläre Sphäroide als dreidimensionales Tumormodell 61 4.1.2 Experimentelle Endpunkte 64 4.1.2.1 Radiosensitivität 65 4.1.2.2 NK-Zell-Migration 66 4.1.3 Untersuchung der EGFR-Expression 67 4.2 Diskussion der Ergebnisse 68 4.2.1 Einfluss von hPSC auf Wachstumsverhalten und Radiosensitivität von PANC-1-Sphäroiden 68 4.2.2 Einflussfaktoren auf die NK-Zell-Migration in PANC-1-Sphäroide 70 4.3 Resümee und Ausblick 72 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 79 7 Literaturverzeichnis 82 Appendix I Danksagung VIII Erklärung IX