DNA-Methylierung als prätherapeutischer Marker der Tumorstrahlenempfindlichkeit

Dr. med. Fabian Klug

AutorIn

Dr. med. Fabian Klug

Titel

DNA-Methylierung als prätherapeutischer Marker der Tumorstrahlenempfindlichkeit

Zitierfähige Url:

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-1037415

Erstveröffentlichung

2026

Datum der Einreichung

12.06.2025

Datum der Verteidigung

31.03.2026

Abstract (DE)

Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) stellen aufgrund einer ungünstigen Prognose weiterhin eine Erkrankung mit Optimierungsbedarf der therapeutischen Versorgung dar. Strahlentherapie stellt eine wichtige Säule dar. Die Tumorstrahlenempfindlichkeit von HNSCC ist jedoch heterogen und es mangelt aktuell an prädiktiven Biomarkern, die die Strahlenempfindlichkeit des Tumors vorhersehen können. Eine vielversprechende Quelle für neue Biomarker stellt die DNA-Methylierung dar. Ziel der Arbeit war die Darstellung strahleninduzierter Veränderungen der DNA-Methylierung in einem strahlenresistenten und einem strahlenempfindlichen HNSCC-Tumormodell unter verschiedenen Experimentierbedingungen. Diese Unterschiede sollten im Bezug zur Strahlenempfindlichkeit funktionell eingeordnet werden und bewertet werden, inwiefern die DNA-Methylierung als Biomarker den γH2AX-Foci-Assay stützen kann. Mit der laser capture microdissection (LCM) sollte zudem eine Methode zur lokal-spezifischen Gewebeauswahl mit anschließender DNA- und RNA-Isolierung aus Gewebe, welches zuvor in Formalin fixiert und Paraffin eingebettet wurde, etabliert werden. Die Methode soll künftig Studien an Gewebe- oder zellspezifischen Bereichen von Gewebeschnitten ermöglichen, um bspw. Methylomanalysen durchführen zu können. Untersucht wurden in dieser Studie die Tumormodelle SAS, UT-SCC-14 als Xenograft unter in-vivo- und ex-vivo-Bedingungen, sowie als Zelllinie unter in-vitro-Bedingungen. Die ARPE-19-Zelllinie diente als gesundes Vergleichsmodell der in-vitro-Experimente. Zur Einschätzung der Strahlenempfindlichkeit wurde das Zellüberleben in Abhängigkeit von aufsteigenden Bestrahlungsdosen (0; 1; 2; 4; 6 Gy) unter Anwendung eines Koloniebildungsassays bestimmt. Weiterhin wurde der γH2AX-Foci-Assay auf in vitro unbestrahlte und bestrahlte (4 Gy) Zellkulturen (2 Proben), und in vivo bzw. ex vivo unbestrahlte und bestrahlte (4 Gy) SAS- und UT-SCC-14-Xenografts (je vier Proben) angewandt. Die γH2AX-Foci wurden mit einem intern entwickelten Algorithmus gezählt. Für die Methylomanalyse wurden aus bestrahltem (4 Gy) und unbestrahltem Material der Xenograft-Modelle (je 4 Proben) und Zellkulturen (je 2 Proben) die DNA isoliert. Im ex-vivo-Experiment wurden die Tumore als Tumorschnittkultur verwendet. Die DNA wurde in der DKFZ-Core Facility unter Verwendung des Illumina Methylation EPIC Assays auf ihre Methylierung untersucht. Die Methylomdaten innerhalb der Modelle wurden mit GenomeStudio in Bezug auf strahleninduzierte Methylierungsänderungen ausgewertet. Die DNA-Bereiche, die ihren Methylierungszustand nach Bestrahlung veränderten, wurden auf funktionelle Zusammenhänge untersucht, indem korrespondierende Genprodukte einer Signalweganalyse durch das Onlinetool Reactome unterzogen wurden. Die Methode der LCM wurde unter Anwendung auf archivierte FFPE-Tumorproben des FaDu-Modells etabliert. Zielsetzung war die experimentelle Bestimmung der geeigneten Parameter des Lasers zum Dissezieren der histologischen Schnitte, sowie der notwendigen Menge dissezierten Materials zur suffizienten DNA- und RNA-Isolierung. Die gewonnenen DNA und RNA wurden mittels qPCR auf ihre Fragmentierung untersucht. Anhand des Koloniebildungsassays konnte beobachtet werden, dass ARPE-19 am empfindlichsten auf Bestrahlung reagiert, während SAS die höchste Koloniebildungsrate bei allen Bestrahlungsdosen aufweist. Die γH2AX-Foci-Daten aus in-vivo- und ex-vivo-Experimenten ergaben einen geringeren Foci-Anstieg nach Bestrahlung im SAS-Modell, was ebenfalls darauf hindeutet, dass sich SAS strahlenresistenter als UT-SCC-14 verhält. Die in-vitro-Daten zeigten jedoch den geringsten γH2AX-Foci-Anstieg im UT-SCC-14 Modell. Das Vergleichsmodell ARPE-19 wies den höchsten Foci-Anstieg nach Bestrahlung unter allen Experimenten auf. Die DNA-Methylierung wurde für in-vivo-, ex-vivo-, und in-vitro-Bedingungen erhoben. Es standen zur Analyse DNA aus unbestrahlten und bestrahlten (4 Gy) Proben zur Verfügung. Es ließ sich eine heterogene Veränderung der DNA-Methylierung der Modelle nach Bestrahlung nachweisen. Im Vergleich der Zelllinien zeigt sich, dass die physiologische Zelllinie ARPE-19 nach Bestrahlung mehr hypo- als hypermethylierte Loci aufweist, wohingegen bei UT-SCC-14 und SAS ein höherer Anteil hypermethylierter Loci auftritt. Es zeigt sich außerdem unter in-vivo- und ex-vivo-Bedingungen, dass SAS einen höheren Anteil hypermethylierter Loci aufweist als UT-SCC-14. In den in-vitro-Daten wiesen beide Tumormodelle einen nahezu gleichen Anteil hypermethylierter Loci auf, wobei der Anteil bei UT-SCC-14 geringfügig höher lag. Anhand der Signalweganalyse stellte sich heraus, dass SAS im Vergleich zu ARPE-19 und UT-SCC-14 eine Veränderung des Methylierungsstatus von DNA-Loci aufweist, deren assoziierte Proteine die Chromatinorganisation betreffen. Von Bedeutung war dabei, dass Signalwege der Chromatinorganisation sowohl unter in-vivo-, als auch ex-vivo- und in-vitro-Bedingungen betroffen waren. Im Detail zeigte sich ein Einfluss der DNA-Methylierungsveränderung auf Signalwege, die die posttranslationale Histonmodifikation betreffen. Hierbei konnte die Histon-Demethylase KDM5D bzw. zugehörige Genabschnitte als möglicher Biomarker identifiziert werden. Anhand von Daten des human protein atlas zeigte sich, dass KDM5D als prognostischer Marker für HNSCC fungiert. Ein wiederholt veränderter Genabschnitt stellt womöglich eine Promoter-Region des Gens dar. Promoter-Regionen weisen in Tumoren häufig eine aberrante Methylierung auf. Weiterhin konnte in UT-SCC-14 ein Hinweis auf eine strahleninduzierte Modulation von Zellzyklus-Signalwegen in vivo dargestellt werden. Es zeigte sich aber keine wiederkehrende Veränderung über Experimentierbedingungen hinweg, die zu einer Ableitung potenzieller Biomarker führen könnte. Die Lasermikrodissektion konnte erfolgreich als Methode etabliert werden und Probenmaterial zur DNA- und RNA-Isolierung gewonnen werden. Ein Protokoll zur Anwendung der Methode mit Hinweisen zum Erstellen der histologischen Schnitte aus FFPE-Blöcken, Empfehlungen zu den Laserparametern und Anleitung zur DNA- oder RNA-Isolierung aus dem gewonnenen Material wurde erstellt. Zur Isolierung von RNA war hierbei eine deutlich niedrigere Menge biologischen Ausgangsmaterials nötig, als es für die DNA-Isolierung der Fall war. Die Daten deuten eine Abhängigkeit der DNA-Ausbeute von der Lagerungsdauer der Paraffinblöcke an. Die Methode sollte weiterentwickelt werden, um in Zukunft biologisches Material für DNA-Isolierungen zur Methylierungsanalyse zu gewinnen, welches eine geringe Verunreinigung durch Fremdgewebe aufweist. Methylomdaten verschiedener HNSCC-Modelle könnten auf weitere prädiktive Biomarker untersucht werden. Zusammenfassend konnten anhand der vorliegenden Arbeit die spezifischen Strahlenempfindlichkeiten der vorgestellten Modelle aufgezeigt werden. Die Analyse der erhobenen der Methylom-Daten ergab heterogene bestrahlungsinduzierte DNA-Methylierungsveränderungen im Vergleich des strahlenresistenten und strahlenempfindlichen Modells. Die funktionelle Auswertung ergab weiterhin, dass Veränderungen des Methylierungsstatus von DNA-Loci des Proteins KDM5D, nur im strahlenresistenten Modell SAS auftraten. Derartige Veränderungen ließen sich in SAS unter allen Experimentierbedingungen nachweisen. Demnach könnte der Methylierungsstatus spezifischer Loci des Proteins als Biomarker der Strahlenempfindlichkeit von Kopf-Hals-Plattenepithelzellkarzinom dienen und andere Methoden wie den γH2AX-Foci-Assay ergänzen. Eine Validierung der Daten steht noch aus. Zudem stehen weitere Auswertungstools wie bspw. RnBeads zur Verfügung, die eine detailliertere Auswertung der Methylom-Daten ermöglichen können.

Freie Schlagwörter (DE)

DNA-Methylierung, HNSCC, Methylom, Methylierung, Strahlenempfindlichkeit

Freie Schlagwörter (EN)

DNA methylation, HNSCC, methylome, methylation, radiosensitivity

Klassifikation (DDC)

610

Klassifikation (RVK)

XH 3304

WG 1790

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