Gezielte Immuntherapie des metastasierten Nierenzellkarzinoms mit Hilfe Antigen-spezifischer Nanopartikel

Dr. rer. medic. Nancy Wetterling

AutorIn

Dr. rer. medic. Nancy Wetterling

Titel

Gezielte Immuntherapie des metastasierten Nierenzellkarzinoms mit Hilfe Antigen-spezifischer Nanopartikel

Zitierfähige Url:

https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa2-1004397

Erstveröffentlichung

2025

Datum der Einreichung

18.07.2025

Datum der Verteidigung

11.11.2025

Abstract (DE)

ie Entwicklung neuartiger Immuntherapien hat in den letzten Jahren enorme Fortschritte bei der Behandlung maligner Erkrankungen erzielt. Viele Behandlungen zielen darauf ab, die meist ineffektiven und erschöpften bzw. supprimierten Immun-Effektor-Funktionem zu reaktivieren und so eine anti-tumorale Immunantwort zu initiieren. Neben den Erfolgen treten jedoch auch Rückschläge auf, wie beispielsweise immunvermittelte Nebenwirkungen oder die Entstehung von Resistenzen, sodass weiterhin ein großer Bedarf an innovativen Therapiekonzepten besteht. Der Einsatz von Bio-Immunkonjugaten (BICs) im Nanopartikelformat (NANO:BICs) eröffnet eine vielversprechende Strategie für die zielgerichtete Immuntherapie maligner Erkrankungen. Aufbauend auf den in der Arbeitsgruppe von Prof. Temme etablierten RICIA zur gezielten Stimulation von EGFRvIII-positiven Tumorzellen wurden in dieser Arbeit PSCA-spezifische NANO:BICs entwickelt. Diese sollten über eine CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN)-vermittelte TLR9-Stimulation tumorinfiltrierenden Immunzellen in PSCA-positiven Nierenzellkarzinom-Metastasen aktivieren. Die Partikel bestanden aus monobiotinylierten Einzelkettenantikörpern gegen PSCA bzw. PSMA als Negativ-Kontrolle, dem Biotin-bindenden Linkerprotein NeutrAvidin sowie monobiotinylierten CpG-ODNs. Untersucht wurden CpG-ODNs, die den humanen oder den murinen TLR9 in unterschiedlichen Assays aktivieren sollten. Darüber hinaus erfolgte die Analyse unterschiedlicher Zucker-Phosphatrückgrate. Zum einen wurden CpG-ODNs mit dem natürlich vorkommenden Phosphodiester (PD)-Rückgrat untersucht, welches jedoch anfällig für Nukleasen und damit potenziell instabil ist. Zum anderen wurden CpG-ODNs mit dem synthetisch modifizierten Phosphothioat (PTO)-Rückgrat verwendet, welches stabiler ist, aber auch unspezifische Interaktionen auslösen kann. Außerdem erfolgte die Analyse von CpG-ODNs mit einem Phosphodiester CpG-ODN und einer Phosphothioat-Modifikation (teil-PTO, tPTO), um die vorteilhaften Eigenschaften beider Rückgrate zu vereinen. Die Komponenten wurden, basierend auf den Ergebnissen unterschiedlicher Titrationsstudien, in definierter molekularer Stöchiometrie assembliert. Ferner wurde das Vorhandensein von ungebundenen CpG-ODNs in der Immunkonjugat-Lösung durch eine Aufreinigung ausgeschlossen. Im ersten Teil der Arbeit erfolgte die Assemblierung der NANO:BICs. Dafür wurden zunächst die Einzelkettenantikörper mithilfe von Produktionszelllinien hergestellt und aufgereinigt. Anschließend wurde ein geeignetes stöchiometrisches Verhältnis für die Konjugation an NeutrAvidin im NANO:BIC über Titrationsstudien ermittelt. Die unterschiedlichen CpG-ODNs wurden ebenfalls titriert und eine geeignete Behandlungskonzentration evaluiert. Zuletzt erfolgte die Aufreinigung der Komplexe, um ungebundene, unbiotinylierte CpG-ODNs zu entfernen. Im zweiten Teil erfolgte die Funktions-Evaluierung der NANO:BICs in vitro. Ergebnisse des HEK-BlueTM-Reportergen-Assays zeigten, dass PTO-CpG-ODN-beladene NANO:BICs die stärkste und PD-CpG-ODNs die schwächste TLR9-spezifische Stimulation hervorriefen. Ferner führte die Behandlung von TLR9-positiven RPMI-8226-PSCA-Zellen mit NANO:BICs zur Freisetzung verschiedener Immunmodulatoren, wobei NANO:BICs mit PD-CpG-ODNs die ausgeprägtesten Rezeptor-spezifischen Effekte verursachten. Mikroskopische Analysen verwiesen auf eine Internalisierung und unspezifische Aufnahme von PTO-CpG-ODN-NANO:BICs und eine Adhäsion von PD- und tPTO-CpG-ODN-NANO:BICs an PSCA-positiven Renca-Luc-PSCA-Tumorzellen. Murine Immunzellen nahmen die Partikel unabhängig der angesteuerten Zielstruktur auf. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass diese nach NANO:BICs-Stimulation eine erhöhte Sekretion an immunstimulierenden Molekülen aufwiesen und eine verstärkte Expression von Aktivierungsmarkern zeigten. Basierend auf den Ergebnissen vorheriger Studien wurde deutlich, dass tPTO-modifizierte CpG-ODNs im Vergleich zu PD- und PTO-CpG-ODNs die potenziell effektivsten Therapieergebnisse erzielten und wurden folglich ausschließlich für weitere Versuche verwendet. Ko-Kultivierungsversuche bestätigten ferner, dass an Tumorzellen adhärierte NANO:BICs von Immunzellen aufgenommen und diese dadurch aktiviert werden konnten. Im letzten Teil der Arbeit wurden die Funktionen der NANO:BICs in vivo in dem syngenen Balb/c-Tiermodell evaluiert. Die initial eingesetzte Dosis der NANO:BICs führte nicht zu einer signifikanten antitumoralen Wirkung und zeigte lediglich Trends zu einer verstärkten myeloiden Zellrekrutierung. Auch eine Dosissteigerung und Anpassung des Behandlungsschemas blieben ohne deutliche Verbesserung. Distributionsanalysen deuteten darauf hin, dass sich die Partikel in den Metastasen unzureichend anreicherten. Für zukünftige Studien empfiehlt sich daher eine Anpassung des Injektionsschemas an die Metastasengröße sowie eine mögliche Erhöhung der therapeutischen Injektionsintervallen, um die Partikelakkumulation zu optimieren und so das anti-tumorale Potenzial der NANO:BICs voll auszuschöpfen. Ferner bietet es sich an, ein syngenes, orthotopes Modell in weiterführenden Studien heranzuziehen, um die natürlichen Metastasierungwege besser nachbilden zu können.

Abstract (EN)

The development of novel immunotherapies has made tremendous progress in the treatment of malignant diseases in recent years. Many strategies aim to reactivate the often ineffective, exhausted, or suppressed effector functions of the immune system and thereby initiate an antitumor immune response. Despite these successes, difficulties such as immune-mediated side effects or the emergence of resistance continue to occur, underlining the ongoing need for innovative therapeutic concepts. Bio-immune conjugates in nanoparticle form (NANO:BICs) offer a particularly promising approach for targeted immunotherapy of malignancies. Building on the RICIA platform established in Prof. Temme’s group - which selectively stimulates EGFRvIII-positive tumor cells via TLR3 - this work developed PSCA-specific, TLR9-targeting NANO:BICs. These were designed to activate tumor-infiltrating immune cells in PSCA-positive renal cell carcinoma metastases through CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) - mediated TLR9 stimulation. Each nanoparticle was assembled from three components in defined stoichiometry: a monobiotinylated single-chain antibody against PSCA (or PSMA as a negative control), the biotin-binding linker protein NeutrAvidin and monobiotinylated CpG-ODNs as TLR9 agonists. CpG-ODNs capable of activating either human or murine TLR9 were tested in various assays. In addition, different sugar-phosphate backbones were compared: the naturally occurring phosphodiester (PD) - which is nuclease-sensitive and potentially unstable, the fully modified phosphorothioate (PTO) - which is more stable but can provoke nonspecific interactions and a partially PTO-modified backbone (tPTO) that combines advantages of both. Unbound CpG-ODNs were removed by purification to avoid nonspecific immune activation. In the first part of the study, the NANO:BICs were assembled. Monobiotinylated single-chain antibodies were produced and purified from scFv-producing cell lines. Titration studies then determined the optimal stoichiometry for conjugation to NeutrAvidin, and suitable treatment concentrations of the various CpG-ODNs were identified. Finally, complexes were purified to eliminate unbiotinylated CpG-ODNs. The second part evaluated NANO:BIC functionality in vitro. A HEK-Blue™ reporter assay revealed that PTO-CpG-ODN-loaded NANO:BICs induced the strongest TLR9-specific activation, whereas PD-CpG-ODNs elicited the weakest response. Treatment of TLR9-positive RPMI-8226-PSCA cells with NANO:BICs triggered the release of multiple immunomodulatory factors, with PD-CpG-ODN particles producing the most pronounced receptor-specific effects. Microscopic analyses showed that PTO-CpG-ODN-NANO:BICs underwent nonspecific uptake, while PD- and tPTO-CpG-ODN-NANO:BICs adhered specifically to PSCA-positive Renca-Luc-PSCA tumor cells. Murine immune cells internalized the particles regardless of targeting moiety and, upon stimulation, exhibited increased secretion of immunostimulatory molecules and upregulation of activation markers. Based on earlier findings, tPTO-modified CpG-ODNs emerged as the most promising and were therefore used exclusively in subsequent experiments. Co-culture experiments further confirmed that tumor-bound NANO:BICs could be taken up by immune cells, leading to their activation. In the final part of this work, NANO:BIC efficacy was tested in vivo in a syngeneic Balb/c mouse model. The initial dosing regimen did not yield a significant antitumor effect, showing only trends toward enhanced myeloid cell recruitment. Increasing the dose and modifying the treatment schedule likewise failed to improve outcomes. Distribution analyses indicated suboptimal accumulation of particles in tumor metastases. For future studies, adjusting injection schemes to metastasis size and increasing the number of therapeutic administrations are recommended to optimize nanoparticle accumulation and fully harness the antitumor potential of NANO:BICs. Additionally, employing a syngeneic, orthotopic model could better recapitulate natural metastatic pathways.

Freie Schlagwörter (DE)

gezielte Immuntherapie, Nanopartikel, Nierenzellkarzinom

Freie Schlagwörter (EN)

targeted immunotherapy, nanoparticles, renal cell carcinoma

Klassifikation (DDC)

610

Klassifikation (RVK)

XH 2004

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